Головна

 Переваги РЦР перед іншими методами |  Області застосування |  ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНОВ МЕТОДОМ мікрочіпів |  МЕТОД СПРЯМОВАНОГО мутагенезу |  ЗАСТОСУВАННЯ РЕГУЛЯТОРНИХ МІКРО-РНК В імунологічні ДОСЛІДЖЕННЯХ |  MiRNA-146 |  MiRNA-155 |  MiRNA-223 - регулятор проліферації і активації нейтрофілів |  Клітини-продуценти цитокінів |  Клітини-мішені |

III. Оцінка клітин-мішеней.

  1.  I. Світова фінансова криза. Оцінка причин і розвитку на світовому рівні
  2.  I. Оцінка клітин-продуцентів.
  3.  I.1 Оцінка ситуації
  4.  I.2 Оцінка розвитку кризи
  5.  II.1 Загальна оцінка
  6.  V. Завдання на рахунок (КА) - оцінка рівня розвитку практіческогоматематіческого мислення. Субтест складається з 20 арифметичних завдань. Час решенетя - 10 хв.

1. Визначення експресії рецепторів цитокінів на рівні генів і білкової молекули (ПЛР, метод проточної цитофлуориметрії).

2. Визначення сигнальних молекул у внутрішньоклітинному вмісті.

3. Визначення функціональної активності клітин-мішеней.

В даний час розроблені численні методи оцінки системи цитокінів, які дають різнопланову інформацію. Серед них розрізняють:

1) молекулярно-біологічні методи;

2) методи кількісного визначення цитокінів за допомогою імуноаналізу;

3) тестування біологічної активності цитокінів;

 

4) внутрішньоклітинний фарбування цитокінів;

5) метод ELISPOT, що дозволяє виявити цитокіни навколо одиничної цітокінпродуцірующей клітини;

6) иммунофлюоресценцию.

Наводимо коротку характеристику цих методів.

За допомогою молекулярно-біологічних методівможна досліджувати експресію генів цитокінів, їх рецепторів, сигнальних молекул, вивчати поліморфізм зазначених генів. В останні роки виконано велику кількість робіт, що виявили асоціацію між варіантами алелей генів молекул системи цитокінів та схильністю

до ряду захворювань. Вивчення алельних варіантів генів цитокінів може дати інформацію про генетично запрограмованої продукції того чи іншого цитокіну. Найбільш чутливою вважається полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі - ПЛР-РВ (див. Гл. 6). метод гібридизації in situ дозволяє уточнити тканинну і клітинну локалізацію Експрес цитокінових генів.

Кількісне визначення цитокінів в біологічних рідинах і в культурах мононуклеарних клітин периферичної крові методом ІФА можна охарактеризувати наступним чином.Оскільки цитокіни є локальними медіаторами, більш доцільно вимірювати їх рівні у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів або в природних рідинах, наприклад в сльозі, змивах з порожнин, сечі, амніотичної рідини, спинномозкової рідини і т.д. Рівні цитокінів в сироватці або інших біологічних рідинах відображають поточний стан імунної системи, тобто синтез цитокінів клітинами організму in vivo.

Визначення рівнів продукції цитокінів мононуклеарами периферичної крові (МНК) показує функціональний стан клітин. Спонтанна продукція цитокінів МНК в культурі свідчить, що клітини вже активовані in vivo. Індукований (різними стимуляторами, митогенами) синтез цитокінів відображає потенційну, резервну здатність клітин відповідати на антигенний стимул (зокрема, на дію лікарських препаратів). Знижена индуцированная продукція цитокінів може служити одним з ознак імунодефіцитного стану. Цитокіни неспецифічні щодо конкретного антигену. Тому специфічна діагностика інфекційних, аутоімунних і алергічних захворювань за допомогою визначення рівня тих чи інших цитокінів неможлива. У той же час оцінка рівнів цитокінів дозволяє отримати дані про тяжкість запального процесу, його перехід на системний рівень і прогнозі, функціональної активності клітин імунної системи, про співвідношення Th1- і Th2-клітин, що дуже важливо при диференціальної діагностики ряду інфекційних та імунопатологічних процесів.

 

У біологічних середовищах можна визначити цитокіни кількісно за допомогою цілого ряду методів імуноаналізу,використовуючи поліклональні та моноклональні антитіла (див. гл. 4). ІФА дозволяє дізнатися, які точні концентрації цитокінів в біо-

рідинах організму. Імуноферментні виявлення цитокінів має ряд переваг перед іншими методами (висока чутливість, специфічність, незалежність від присутності антагоністів, можливість точного автоматизованого обліку, стандартизації обліку). Однак і цей метод має свої обмеження: ІФА не характеризує біологічну активність цитокінів, може давати помилкові результати за рахунок перехресно-реагують епітопів.

біологічне тестуванняпроводять на основі знання основних властивостей цитокінів, їх дії на клітини-мішені. Вивчення біологічних ефектів цитокінів дозволило розробити чотири різновиди тестування цитокінів:

1) по індукції проліферації клітин-мішеней;

2) по цитотоксическому ефекту;

3) по індукції диференціювання кістково-мозкових попередників;

4) по противірусного дії.

ІЛ-1 визначають за стимулюючій дії на проліферацію мишачих тимоцитов, активованих мітогеном in vitro; ІЛ-2 - по здатності стимулювати проліферативну активність лімфобластів; по цитотоксичної дії на мишачі фібробласти (L929) тестують ФНОа і лімфотоксин. Колонієстимулюючі фактори оцінюють по їх здатності підтримувати зростання кістковомозкових попередників у вигляді колоній в агарі. Противірусну активність ІФН виявляють по пригнічення цитопатичної дії вірусів в культурі диплоїдних фібробластів людини та пухлинної лінії фібробластів мишей L-929.

Створено клітинні лінії, зростання яких залежить від присутності певних цитокінів. У табл. 7.1 представлений список клітинних ліній, які використовуються для тестування цитокінів. За здатністю індукувати проліферацію чутливих клітин-мішеней проводять біотестування ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-15 та ін. Однак ці методи тестування відрізняються недостатньою чутливістю і інформативністю. Молекули інгібіторів і антагоністів можуть маскувати біологічну активність цитокінів. Деякі цитокіни виявляють загальну біологічну активність. Проте ці методи ідеальні для тестування специфічної активності рекомбінантних цитокінів.

 

Таблиця 7.1.Клітинні лінії, які використовуються для тестування біологічної активності цитокінів

Закінчення табл. 7.1

Лабораторна робота 7-1



 I. Оцінка клітин-продуцентів. |  Порядок роботи
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати