Головна

ГЛАВА 12

1. Перетворення триптофану в індол за допомогою тріптофанази, яка синтезується в хазяйських клітинах Е. coli.

2. Окислення індолу до цис-індол-2,3-дігідродіола під дією нафталін-діоксигенази, яка кодується ДНК, переклонірованной з плазміди NAH7.

3. Спонтанна дегідратація.

4. Окислення на повітрі з утворенням індиго.

Таким чином, комбінація ферментів двох різних метаболічних шляхів двох різних організмів привела до несподіваного синтезу барвника індиго. введення в Е. coli гена ксілолоксідази, що міститься в плазмиде TOL, може забезпечити перетворення триптофану в індоксіл, спонтанно окислюється до індиго (рис. 12.6).

Індиго, синій пігмент, який застосовується для фарбування бавовни і шерсті, був вперше виділений з рослин; Зараз його отримують шляхом хімічного синтезу. За оцінками, в рік виробляється приблизно 1,5 · 107 кг цього барвника на суму близько 200 млн. дол. Індиго забарвлюють джинсову тканину, і обсяг його продажів більше, ніж будь-якого іншого барвника. Можливість отримання індиго за допомогою мікроорганізмів дозволяє розробити досить ефективний і економічний великомасштабний мікробіологічний спосіб його виробництва, що дає можливість обійтися без використання таких токсичних речовин, як анілін, формальдегід і ціанід, які необхідні при хімічному синтезі індиго. В даний час біотехнологи намагаються підібрати оптимальні умови вирощування великої кількості штаму Е. coli, здатного до синтезу індиго. Серед підбираються параметрів температура, pH і кількість триптофану в середовищі, що забезпечує максимальний вихід

 Мал. 12.6. Біосинтез індиго з триптофану, здійснюваний генетично модифікованої Е, coli. Тріптофаназа - один з ферментів, що продукуються E. coli. Ген нафталіндіоксігенази, що каталізує реакцію А, відбувається з плазміди NAH, а ген ксілолоксідази, що каталізує реакцію Б, - з плазміди TOL. У трансформованих клітинах E. coli індиго синтезується або по шляху А, або по шляху Б, але не по них обох одночасно.

Використання рекомбінантнихмікроорганізмов для отримання комерційних продуктів 255

 Мал. 12.7. Схематичне зображення біореактора, в якому можна було б здійснювати синтез індиго з використанням рекомбінантних клітин Е. coli. Клітини іммобілізовані на частинках твердого матриксу. У реактор безперервно подається субстрат (триптофан) і безперервно виводиться продукт (індиго). Швидкість перенесення речовини через реактор лімітується швидкістю перетворення субстрату в продукт.

продукту. Ця система ще не готова для комерційного використання, але вже ясно, що мікробіологічний процес міг би проходити в біореакторі, в якому рекомбінантні E. coli хімічно іммобілізовані на твердій матриці (наприклад, на целюлозі або силікагелі). Реактор міг би працювати в безперервному режимі, з надходженням триптофану з одного його боку і видаленням індиго з іншого (рис. 12.7).

синтез амінокислот

Амінокислоти широко застосовуються в харчовій промисловості - як підсилювачі смаку і аромату, антиоксидантів і харчових добавок; в сільському господарстві - в якості кормових добавок; в медицині - для терапії післяопераційних хворих; в хімічній промисловості -як вихідних речовин при синтезі полімерів і виробництві косметичних засобів (табл. 12.1). За оцінками, щорічно в світі виробляється більше 800 000 т амінокислот вартістю понад 5 млрд. Доларів. При цьому більше половини загального обсягу виробництва припадає на частку L-глутамінової кислоти, яка використовується для отримання широко відомого підсилювача смаку та аромату - глутамату натрію.

У промисловому масштабі амінокислоти отримують в основному або екстракцією з білкових гідролізатів, або як продукти метаболізму двох неспорулірующіх грампозитивних грунтових бактерій, Corynebacterium або Brevibacterium spp. Зазвичай для підвищення продуктивності цих мікроорганізмів використовується мутагенезу з подальшим відбором штамів - сверхпродуцентов певних амінокислот. Однак такий спосіб отримання штамів вимагає багато часу, а ефективність його невелика. Альтернативний підхід міг би полягати у виділенні і зміні специфічних генів, що кодують ключові ферменти певних біохімічних реакцій, на підставі детальних біохімічних даних про ці ферментах. Втім, такий генноїнженерний підхід може виявитися не настільки простим. Так, в біосинтезі деяких амінокислот можуть брати участь кілька ферментів, які активуються або ингибируются різними метаболітами, присутніми в клітці. У такій ситуації важко визначити, який фермент потрібно модифікувати, щоб збільшити вихід кінцевого продукту. Крім того, вчені поки не мають у своєму розпорядженні вичерпних даних про біохімічні властивості зазначених вище мікроорганізмів, а відповідні генно-інженерні підходи знаходяться на стадії розробки. Зокрема, тільки створюються експресують вектори і методики трансформації для грампозитивних організмів типу Corynebacterium и Brevibacterium spp.

Більшість плазмідних векторів з широким колом господарів реплицируются тільки в грамнегативних мікроорганізмів, тому необхідно створити вектори, спеціально призначені для експресії в Corynebacienum и Brevibacterium spp. Це могли б бути човникові вектори Е. coli-Corynebacterium. Ta їх частина, яка відбувається з плазмід E. coli, може містити




 Джерела виникнення і розрахунок економічного ефекту від впровадження організаційно-технічних заходів |  ГЛАВА 12
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати