Головна

іммобілізованих ФЕРМЕНТИ

  1. гідролітичні ферменти
  2. ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТИ
  3. Глюконеогенез. Основні субстрати, ключові ферменти процесу. цикл Корі
  4. Класифікація ферментів. Загальна характеристика класу ЛіАЗ. Коферменти ліазних дирекцію.
  5. Класифікація ферментів. Загальна характеристика класу трансфераз. Основні підкласи. Коферменти трансферазную реакцій.
  6. Коферменти і їх функції в ферментативних реакціях. Вітамінні коферменти. Приклади реакцій за участю вітамінних коферментів.

У різних харчових технологіях довгий час застосовувалися лише препарати вільних ферментів, термін використання яких - один виробничий цикл. Однак досягнення молекулярної біології, біохімії і ензимології привели до того, що в даний час будову і функції багатьох ферментів вивчені дуже детально і це дозволило створити теоретичну базу для виробництва ферментів пролонгованої дії або іммобілізованих ферментів, т. Е. Фіксованих або пов'язаних ферментних препаратів.

Сутність іммобілізації ферментів полягає в приєднанні їх в активній формі той чи інший спосіб до інертної матриці (зазвичай це нерозчинний полімерний носій).

Іммобілізацію ферменту можна визначити і як включення молекули ферменту в будь-яку ізольовану фазу, яка відокремлена від фази вільного розчину, але здатна обмінюватися знаходяться в ній молекулами субстрату, еффектора або кофактора.

Фаза ферменту зазвичай нерозчинні у воді і часто являє собою високомолекулярний гідрофільний полімер, наприклад, целюлозу, поліакриламід, сефарозе і т. П.

Принципи та способи іммобілізації.Включення ферменту в ізольовану фазу здійснюють різними способами: фермент може бути ковалентно пов'язаний з цією фазою, адсорбований на ній або фізично включений в неї.



Можливі такі способи іммобілізації ферменту.

1. Ковалентне зв'язування. Молекула ферменту Коваль-тно зв'язується з нерозчинним полімером. Полімер може бути у вигляді порошку або в формі плівки. Іноді молекули ферменту з'єднуються ковалентними зв'язками між собою або з яким-небудь інертним білком; при цьому утворюється нерозчинний, але активний полі-

мірний фермент (рис. 8.11).

2. Електростатичне
 зв'язування. Цей спосіб іммобі-
 лизации заснований на використанні електро-
 тростатіческіх або інших нековалент-
 них механізмів зв'язування (рис. 8.12).

3. Сополимеризация з по-
 міццю многофункціональ-
 них реагентів. зв'язування молі-
 кул ферменту з білками (наприклад, з
 альбуміном) або один з одним здійс-
 ствляется за рахунок використання визна
 ділених реагентів. В якості такого
 багатофункціонального реагенту часто
 використовують глутаровий альдегід, геле-
 утворює дію якого извест-
 але давно. У цьому способі необхідно
 уникати взаємодії реагенту з ак-
 нормативним центром ферменту і інгібування
 вання останнього (рис. 8.13).


4. Включення в полімер. У цьому способі фермент не прикріплений до полімеру, але утримується всередині нього, оскільки останній утворює навколо ферменту сетеобразной матрицю (рис. 8.14). Осередки цієї матриці настільки малі, що молекула ферменту не може звільнитися з мережі, але в той же час досить великі для проникнення низькомолекулярних субстратів. Прикладом такого способу іммобілізації можуть служити:

а) включення в ліпосоми, коли фермент знаходиться в водному раство-
 ре, оточеному Фосфоліпідний бар'єром (рис. 8.15);

б) гідрофобна взаємодія, коли фермент «занурений» в гідро-
 ФОБН частина подвійного ліпідного шару (рис. 8.16).

5. инкапсулирование. Включення ферменту в органічну або неорганічну капсулу, яка представляє собою напівпроникну мембрану (рис. 8.17).

Вибір способу іммобілізації.Мистецтво іммобілізації ферментів полягає в правильному виборі відповідного методу. цей вибір


визначається цілою низкою чинників, багато з яких неможливо виявити до тих пір, поки метод не буде випробуваний.

Первинний відбір здійснюється зазвичай емпіричним шляхом. Спочатку потрібно вирішити, чи необхідний для прикріплення ферменту будь-якої специфічний носій, чи не буде процедура іммобілізації инактивировать фермент і чи зможе іммобілізований фермент дійсно функціонувати в тих умовах, при яких його належить використовувати.

Тому для успішної іммобілізації слід по можливості прийняти до уваги наступні фактори:

- Фермент повинен бути стабільним в умовах протікання реакції;

- Реагенти, що утворюють поперечні зшивки, не повинні взаімодейство-
 вать з хімічними угрупованнями активного центру. У зв'язку з цим
 поперечно-сшивающий реагент повинен бути якомога більших роз-
 меров, що буде перешкоджати його проникненню в активний центр;

- Завжди, коли це можливо, необхідно тим чи іншим способом
 захищати активний центр (наприклад, обробка тіолових
 ферментів глутатионом або цистеїном);

- Процедура промивання для видалення «непрішітого» ферменту по-
 жна мати шкідливого впливу на іммобілізований фермент;

- Полімерна матриця не має бути субстратом для іммобілі-
 зованного ферменту;

- Необхідно, нарешті, враховувати механічні властивості носія, осо
 ливо його механічну міцність і фізичну форму.

Процес іммобілізації ферменту можна продемонструвати на прикладі зв'язування глюкоамілази з носієм - ацетілетілцеллю-лозою.


Носій витримують добу в дистильованої воді для набухання. Далі до набряклої ацетілетілцеллюлозе додають спочатку натрій-ацетатний буфер з рН 5,5, а потім розчин очищеного ферменту; після перемішування до суміші додають поперечно-сшивающий агент - гли-тарів альдегід. Через кілька годин отриманий препарат промивають послідовно натрій-ацетатний буфером і розчином хлористого натрію для видалення несорбірованного на носії ферменту. Іммобілізований таким чином фермент зберігається під шаром води або буфера при 3-5 ° С.

В даний час розроблені методи іммобілізації безлічі ферментів. Один і той же фермент можна иммобилизировать декількома методами. Наприклад, глюкозоізомеразу з S. phaeochromogenes можна иммобилизовать на різних носіях: пористом алюмінії, ДЕАЕ-целюлозі, ДЕАЕ-крохмалі і ін. Лактатдегідрогеназа можна включити в гель, прикріпити до носія поперечної зшивкою; Аспара-гіназу - прикріпити до носія сорбційним шляхом або хімічної (ковалентного) зв'язком. У табл. 8.4 представлені деякі методи іммобілізації для різних ферментів.

Вплив іммобілізації на ферментативну активність.Іммобілізація часто призводить до різких змін основних параметрів ферментативної реакції: максимальної швидкості (Vmax); константи Мі-хаеліса (Kmax); оптимуму рН і температури, а також ставлення до інгібіторів.

Ступінь і природа цих змін залежать не тільки від використовуваного методу іммобілізації, а й від типу ферментативної реакції. Великий вплив на ферментативну активність може надавати полімерна матриця, причому цей вплив може проявлятися як у вигляді впливу на микроокружение ферменту, так і безпосередньо на саму молекулу ферменту. Крім того, самі умови іммобілізації (значення рН, присутність вільних радикалів, що окислюють агентів і т. П.) Можуть приводити до часткової або повної інактивації ферменту.

При розгляді впливу іммобілізації на ферментативну активність одним з важливих є питання про ефективні кінетичних параметрах.

параметри Kmax і Vmax, Використовувані для характеристики каталітичних властивостей ферментів в розведених розчинах (див. Розд. 8.2), не можуть бути застосовані в їх строгому математичному значенні для характеристики іммобілізованих ферментів, т. К. Спостерігаються істотні відхилення від гіперболічної субстратной кривої, що описується рівнянням Міхаеліса-Ментен, і викривлення прямолінійних графіків в подвійних зворотних координатах (рівняння Лайнуівера-Берка).



З цієї причини в разі іммобілізованих ферментів краще заново визначити фізичний зміст даних кінетичних параметрів. Раніше з цією метою використовувався параметр «уявна» Доm, Але пізніше було запропоновано користуватися двома константами: Km і VS.

VS - Найвища швидкість, яку можна досягти (теоретично) в даній системі, т. Е. Коли фермент повністю насичений субстратом. Отже, цей параметр відображає вихідні властивості іммобілізованого ферменту, але на нього можуть впливати дифузійні обмеження.

Km - Така концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює VS/ 2. Цей параметр відображає реальні властивості субстрату і залежить від ефекту розподілу і дифузійних обмежень.

величина Кm (Здається) не може відображати справжній стан, т. К. Варіює залежно від обраного діапазону концентрацій субстрату. Наприклад, обмеження дифузії субстрату сильніше проявляється при низьких концентраціях субстрату, а ефект розподілу більш виражений при низьких іонних силах. Від цих двох факторів залежить видима легкість зв'язування ферменту з субстратом, і тому вони справляють істотний вплив на параметр Кm (Здається).

Необхідно також враховувати і виникнення кооперативних ефектів в поведінці іммобілізованих ферментів у відповідь на зміну концентрації субстрату. Іммобілізовані ферменти (на відміну від аллостеріческіх, які виявляють або тільки позитивну, або тільки негативну кооперативность) здатні виявляти обидва види кооперативності в залежності від рН і мікрооточення. Кооперативні ефекти мають важливе значення, т. К. Дозволяють виявити як значні зміни швидкості реакцій в невеликому діапазоні концентрацій субстрату, так і малі зміни швидкості реакції в інших, дуже широких діапазонах концентрацій субстрату.

Застосування іммобілізованих ферментів.Іммобілізовані ферменти як каталізатори багаторазового дії можна використовувати, в основному, для трьох практичних цілей: аналітичних, лікувальних і препаративних.

При вирішенні питання про доцільність використання системи з іммобілізованим ферментом слід керуватися наступними критеріями: ефективністю, вартістю і можливістю здійснити процес за допомогою іншої системи.

У разі препаратівного (промислового) застосування основну роль грає вартість, а також можливість автоматизації процесу. Незважаючи на великі потенційні можливості використання іммобілізованих ферментів в виробництві, в даний час реалізовані лише деякі, наприклад:



-Поділ D- і L-амінокислот, засноване на використанні плес-
 Невою аміноацілази (Н. Ф. 3.5.1.14), иммобилизованной на ДЕАЕ-
 сефадексе;

-отримання сиропів з високим вмістом фруктози з використанням
 ням глюкозоізомерази (Н. Ф.5.3.1.18), иммобилизованной на целю-
 Лозно іонообміннику;

-можливо використання іммобілізованих ферментів при ви-
 водстве сирів, стабілізації молока і видаленні лактози з молоч-
 них продуктів.

Спиртні напої і пивоваріння | Ферментативна МЕТОДИ АНАЛІЗУ харчових продуктів


Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції. | Механізм ферментативної реакції | КЛАСИФІКАЦІЯ І НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ | оксидоредуктази | гідролітичні ферменти | ЗАСТОСУВАННЯ ФЕРМЕНТОВ В ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЯХ | Борошномельне виробництво і хлібопечення | Виробництво крохмалю та крохмалепродуктів | кондитерське виробництво | Виробництво плодово-ягідних соків, безалкогольних напоїв і вин |

© 2016-2022  um.co.ua - учбові матеріали та реферати