Головна

гідролітичні ферменти

  1. ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТИ
  2. Глюконеогенез. Основні субстрати, ключові ферменти процесу. цикл Корі
  3. іммобілізованих ФЕРМЕНТИ
  4. Класифікація ферментів. Загальна характеристика класу ЛіАЗ. Коферменти ліазних дирекцію.
  5. Класифікація ферментів. Загальна характеристика класу трансфераз. Основні підкласи. Коферменти трансферазную реакцій.
  6. Коферменти і їх функції в ферментативних реакціях. Вітамінні коферменти. Приклади реакцій за участю вітамінних коферментів.

Роль ферментів класу гідролаз в харчових технологіях дуже велика. Це знаходить відображення в спеціальній літературі, монографіях, технічних інструкціях, стандартах. Тому в цьому розділі зупинимося на короткій характеристиці найбільш важливих представників гидролитических ферментів. Для технологів найбільший інтерес представ-



ляють три підкласу ферментів класу гідролаз. Це ферменти, що діють на складноефірні зв'язку - естерази (Н. Ф.3.1); діючі на гликозидні з'єднання - глікозідази (Н. Ф.3.2) і діючі на пептидні зв'язку - протеази (Н. Ф.3.4).

Естерази (Н. Ф.3.1). Цей підклас включає велику кількість ферментів (близько 150), які розділені на сім подподкласса: ферменти, що діють на ефіри карбонових кислот (3.1.1); естерази тіолових ефірів (3.1.2); гідролази фосфорних моноефіри або фосфатази (3.1.3); гідролази фосфорних діефіров (3.1.4); гідролази моноефіри оліго- фосфорних кислот (3.1.5); сульфатази (3.1.6); естерази моноефіри ді-фосфорних кислот (3.1.7).

Найбільш важливими з точки зору участі в різних біохімічних процесах, що мають місце при зберіганні і переробці харчової сировини, є ферменти подподкласса 3.1.1.

ліпаза (Н. Ф.3.1.1.3). Ліпаза або триацилгліцеролів-ліпаза широко поширена в природі і грає важливу роль в процесах, що протікають при переробці та зберіганні харчових продуктів. В даний час виділені і охарактеризовані ліпази рослинного походження (ліпаза рицини, пшениці та інших злаків), тваринного (панкреатична ліпаза, ліпаза молока) і мікробного (бактеріальні та грибні ліпази).

Зазвичай ліпази каталізують реакцію розщеплення тригліцеридів відповідно до наведеного нижче сумарному рівнянню:

Причому краще гідролізуються зв'язку в положенні 3 і 1 і лише потім в положенні 2. Численні експериментальні дані дають підставу припустити наступний шлях ліполізу:


тригліцериди > 1,2-диглицерид > 2-моногліцерид > гліцерин

Встановлено, що ліпази швидше отщепляют залишки високомолекулярних жирних кислот, ніж нижчі карбонові кислоти. Ферментативний гідроліз ліпідів має істотну відмінність від інших гидролитических реакцій. Парадокс полягає в тому, що ліпаза - водорозчинний фермент, а її субстрат гидрофобен; однак активність ліпази зростає на кордоні «вода-ліпід». Цей феномен відомий під назвою «межфазная активація».

Ліпази різного походження сильно відрізняються один від одного по специфічності дії, спорідненості до різних субстратів, розчинності, оптимуму рН і іншим властивостям. Так, наприклад, ліпаза насіння рицини нерастворима в воді, має оптимум рН 4,7-5,0; панкреатическая липаза розчинна, і оптимум рН її дії лежить в слабощелочной середовищі. Ліпази мікробного походження і ліпаза пшеничних зародків також відрізняються від ліпази рицини. Вони розчиняються у воді і мають рН оптимум при 8,0. Ліпаза молока, молекулярна маса якої приблизно 7000 Так, має оптимум рН 9,0-9,2 при гідролізі молочного жиру.

Зернова липаза бере участь в процесі псування зернових продуктів при зберіганні. Особливо це стосується продуктів, що містять підвищену кількість жиру, наприклад, вівсяної муки або крупи, пшона. Накопичення вільних жирних кислот під дією ліпази (зростання кислотного числа жиру) - ознака погіршення якості продукту. Вільні жирні кислоти, особливо ненасичені, легко піддаються окисленню під впливом різних факторів: ліпоксигенази, теплової обробки, кисню повітря, сонячного світла і ін. Таким чином, ліпази можуть ініціювати процес прогоркания і обмежувати терміни зберігання харчових продуктів.

Одна з особливостей липаз пов'язана з тим, що ці ферменти здатні каталізувати і зворотну реакцію, здійснювати синтез складних ефірів, а також виробляти переетерефікацію тригліцеридів, т. Е. Змінювати їх жирнокислотний склад. На цій підставі розробляються способи отримання нових форм жирових продуктів з використанням специфічних липаз. Так, наприклад, шляхом реакції переетеріфі-ції робляться спроби отримання жиру - аналога масла какао з дешевого вихідної сировини.

пектінестераза (Н. Ф.3.1.1.11). Пектінестераза синтезуються вищими рослинами, мікроскопічними грибами, дріжджами і бактеріями. Пектінестераза каталізує гідроліз складноефірних зв'язків в молекулі розчинної пектину, в результаті чого утворюється метиловий спирт і полігалактуронових кислота. Процес протікає згідно з наступною схемою (стрілками показано дію ферменту):




Таким чином, пектінестераза отщепляет метоксільние групи від метоксильованих полігалактуронової кислоти (див. Також гл. Вуглеводи).

Желирующая здатність пектину залежить від ступеня метоксіліро-вання або ступеня етерифікації, тому дія пектінестераза по отщеплению метоксільних груп призводить до зниження желюючий здатності і супроводжується падінням в'язкості. На цьому, очевидно, і грунтується застосування цього ферменту для освітлення плодових соків і вина. Зазвичай комплексні препарати пектолітіческіх ферментів, що застосовуються для цих цілей, отримують з різних цвілевих грибів, і перш за все з A. niger.

Гідролази глікозидів або глікозідази (Н. Ф.3.2).Цей підклас включає близько ста ферментів з різною специфічністю дії, осуществяется гідроліз оліго і полісахаридів; деякі ферменти цього типу здатні здійснювати трансферазную реакції - переносити гликозидні залишки на олиго- і полісахариди, нарощувати полісахаридні ланцюжки. Представники гликозидаз були одними з перших ферментів, оборотність дії яких in vitro була експериментально доведена.

Основною формою запасних вуглеводів в насінні і бульбах рослин є крохмаль. Ферментативні перетворення крохмалю лежать в основі багатьох харчових технологій. Тому ферменти амілолітична-го комплексу рослинного, тваринного і мікробного походження інтенсивно вивчаються з часу їх відкриття Кирхгофом в 1814 р і до теперішнього часу.

а-Амілаза (Н. Ф.3.2.1.1). ?-Амілази виявлені у тварин (в слині і підшлунковій залозі), в рослинах (проросле зерно пшениці, жита, ячменю), вони виробляються пліснявими грибами і бактеріями. Всі ці ферменти гідролізують крохмаль, глікоген і споріднені ? -1,4-глкжани з утворенням, головним чином, декстринів і невеликої кількості дисахарида - мальтози.

?-Амілази гидролизуют ?-1,4-зв'язки всередині молекули крохмалю, розриваючи зв'язок між першим вуглецевим атомом і киснем, що зв'язує цей вуглець з сусідньої молекулою глюкози. Це наочно демонструє наступна схема (стрілками показано дію ферменту):


Швидкість, з якою ?-амілази гідролізують глюкани різного ступеня полімеризації, швидко зменшується в міру її зниження. Амилоза - лінійна фракція крохмалю, гідролізується швидше, ніж аміло-пектин, який має розгалужену структуру.

Швидкість гідролізу ?-амілазою залежить від виду і стану крохмалю (нативний або клейстерізованний крохмаль), а також від ефективності самих амілаз. На підставі паралельно проводилися дослідів (в одних - діяли препаратами амілаз на клейстерізованний крохмаль, а в інших - еквівалентними концентраціями на нативні крохмальні зерна) було показано, що ефективність амілаз різного походження зменшується в наступному порядку: панкреатическая, солодове, бактеріальна, грибна.

Характерною особливістю всіх ?-амілаз є наявність одного атома Са на молекулу ферменту. Роль кальцію полягає в тому, що він стабілізує вторинну і третинну структуру молекули ?-амілази, забезпечуючи таким чином її каталітичну активність і разом з тим оберігаючи фермент від дії протеолітичних ферментів і теплової денатурації. Різні ?-амілази відрізняються за молекулярною масою, стійкості до нагрівання і деякими іншими показниками. Молекулярна маса ?-амілаз близька до 50 000 Так, за винятком бактеріальної ?-амілази, яка має молекулярну масу 96 900 Так (кристалічний препарат). Так, наприклад, широко застосовувана в промисловості ?-амілаза з цвілевих грибів A. oryzae, отримана в кристалічному вигляді, має молекулярну масу 51 860 Так.

Велике практичне значення має вплив температури і рН на стабільність амілаз. Швидке руйнування зерновий ?-амілази при рН 3,3-4,0, наприклад, дає можливість випікати житній хліб з борошна, яка містить надлишок ?-амілази, при низьких значеннях рН, щоб запобігти зайвому декстрінірованіе крохмалю і утворення клейких речовин в м'якушки хліба .

Говорячи про термостабильности ?-амілаз різного походження, можна розташувати їх в наступному ряду в міру зниження стійкості до нагрівання: бактеріальні амілази - зернові амілази - грибні амілази. Останніми роботами в області вивчення амілаз показано, що в насінні рослин присутні два типи ?-амілази: ?-амілаза дозрівання і ?-амілаза проростання.



У созревающем зерні синтезується ?-амілаза дозрівання, яка потім переходить в латентну форму, локалізуючись на мембранах алейроновогошару. Перший етап гідролізу крохмалю при проростанні здійснюється цієї ?-амілазою. І тільки на наступному етапі в роботу включається знову синтезується фермент - ?-амілаза проростання. Її синтез в клітинах зародка і алейронового шару починається при вологості зерна вище 28%. Дві форми ?-амілази насіння злаків розрізняються по термостабільності: ?-амілаза дозрівання при 70 ° С втрачає 50% своєї активності, тоді як ?-амілаза проростання при цій температурі тільки незначною мірою зменшує свою активність.

Інтенсивність гідролізу крохмалю в переробляється сировина, як уже зазначалося раніше, визначається взаємодією багатьох чинників. Це перш за все стан амілаз дозрілого зерна і можливість переходу частини латентної форми у вільний стан. Це і стан субстрату, його доступність дії ферменту (атакується субстрату). Велике значення має і фракційний склад крохмальних гранул, співвідношення дрібних і великих зерен, а також зміст пошкоджених зерен крохмалю, які легше піддаються дії ферментів.

Як було встановлено в останній час, важлива роль в цьому процесі належить протеолітичних ферментів. Протеази, здійснюючи обмежене розщеплення білків, сприяють звільненню амілаз з зв'язаного стану, а також гидролизуют ту частину запасних білків, яка міцно пов'язана з поверхнею крохмальних гранул, полегшуючи тим самим доступ ферменту до субстрату.

Потужним механізмом регуляції швидкості розщеплення крохмальних гранул є система білкових інгібіторів амілаз, широко представлених в рослинах. Інгібітори білкової природи вибірково взаємодіють з амілазами і утворюють неактивні комплекси «амілаза-інгібітор». Високою активністю володіють інгібітори амілаз картопляного соку. З зерна пшениці виділено інгібітор з двома активними центрами (двухцентровой). Один активний центр має спорідненість до протеазам і здатний блокувати їх дію. Інший активний центр має спорідненість до амілази. Таким чином, один інгібітор білкової природи здатний блокувати роботу як протеаз, так і амілаз. У образующемся надмолекулярному комплексі інгібітор виконує своєрідну роль сполучної ланки, пригнічуючи активність ферментів різного механізму дії.

?-Амілаза (Н. Ф.3.2.1.2). ?-Амілаза відщеплює мальтозу від нередуці-рующего кінця ланцюга, розриваючи гликозидні зв'язку через одну. Назва «?-амілаза» було вибрано для того, щоб показати, що мальтоза утворюється в ?-аномерного формі. Це не означає, що в молекулі крохмалю присутні ?-зв'язку, а вказує скоріше на те, що відбувається інверсія конфігурації, яка може мати місце в процесі ферментатів-


ного перетворення речовини, що містить асиметричний атом вуглецю. Така інверсія була відкрита П. Вальденом в 1893 р і тому названа вальденовской інверсією. На представленій нижче схемі дію ?-амілази на амилозу і амилопектин показано стрілками.

Таким чином, діючи впорядковано, ?-амілаза послідовно відщеплює залишки мальтози з нередуцирующего кінця до тих пір, поки не зустрінеться точка розгалуження зі зв'язком ?-1,6. При цьому амилоза під дією ?-амілази розщеплюється до мальтози на 100%, а при дії ?-амілази на амилопектин крім утворюється мальтози залишається незайманою велика, сильно розгалужена серцевина, так званий «кінцевий декстрин», т. К. Фермент припиняє свою дію за 2-3 залишку глюкози від точок розгалуження.

?-амілаза - це ферменти в основному рослинного походження. Добре відомими джерелами є зерно пшениці, а також пшеничний і ячмінний солод, соєві боби, бульби картоплі.

На відміну від ?-амілази, ?-амілаза менш термостабильна, але проявляє велику стійкість до кислих значень рН, зберігаючи свою активність при рН 3,3. Це знайшло своє відображення в способі поділу а-і р-амілаз солоду, де обидва ферменту присутні одночасно.

глюкоамилаза (Н. Ф.3.2.1.3). Глюкоамилаза (?-амілаза) продукується різними видами цвілевих грибів роду Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory і деякими іншими, наприклад, Rhizopusdelamarn Rhizopus niveus. Ці ферменти розщеплюють як амилозу, так і амилопектин до глюкози, послідовно діючи з нередуцирующего кінця ланцюга крохмалю. Вони здатні гідролізувати ? -1,4 і ? -1,6 гликозидні зв'язку.



Різні глюкоамілази відрізняються один від одного швидкістю гідролізу крохмалю, ставленням до температури і рН, і деякими іншими показниками. На використанні препаратів грибний глюкоамілази розроблений ферментативний метод отримання глюкози, який набув широкого поширення в Японії.

пуллуланаза (Н. Ф. 3.2.1.41). Раніше цей фермент був відомий під іншими назвами - R-фермент, гранична декстриназ, дебранчінг-фермент.

Пуллуланаза є ендогенних ферментом, вона здатна хаотично гідролізувати ?-1,6-глікозидні зв'язку в пуллулане, амілопектину, глікогені і граничних декстринах, які виходять при спільному впливі на крохмаль і глікоген ?- і ?-амілаз. Найбільш частим відчіплювати фрагментом є мальтотріоза. На представленій нижче схемі дію пуллулонази на пуллулан показано стрілками.


(Від 48 000 до 143 000 Так) і по різному ставляться до температури і рН, дії інгібіторів і активаторів.

Інулаза (Н. Ф. 3.2.1.7). Фермент здійснює гідродіз інуліну та інших поліфруктозанов по | 3-1,2-фруктозідной зв'язку, починаючи з ?-фрук-тозідного кінця полімеру. В результаті утворюється фруктоза і єдина молекула глюкози на одну молекулу інуліну. При повному гідролізі інуліну виходить 95% фруктози і 5% глюкози.

Фермент гидролизует головним чином інулін; сахароза, рафіноза також гідролізуються, але з незначною швидкістю. Інулаза міститься в тих же рослинах (топінамбур, цикорій), в яких присутня інулін. Активна інулаза продукується Aspergillus awamori BKM-808 при глибинному культивуванні. Препарат володіє високою стабільністю до Н+-іон і температурі. Оптимум рН дії 4,5; оптимум температури - 65 ° С.

Отримані з інуліну фруктозні сиропи можуть бути широко використані в кондитерській промисловості і дієтичному харчуванні.

?-фруктофуранозидази (Н. Ф.3.2.1.26). Інші назви цього ферменту - інвертаза або сахараза.

Для промислового виробництва мають значення тільки ферменти з S. cerevisiae і S. carlsbergensis. ?-фруктофуранозидази виділяють з дріжджів шляхом автолиза. Цей фермент гідролізує сахарозу по ?-фрук-тозідной зв'язку відповідно до рівняння:

В результаті дії ферменту на сахарозу виходить суміш еквівалентні-молярних кількостей ? -глюкози і ?-фруктози, що отримала назву «ін-вертного цукру». Термін «інверсія» позначає зміни, що відбуваються в здатності цукру обертати площину поляризованого світла. Це можна виразити наступною схемою:



Продуцетамі пуллуланаза є Aerobacter aerogenes, Bacillus cereus, Bacillus polimyxa, Bacillus sp. і Streptomyces. Ферменти, отримані з різних джерел, мають різної молекулярної масою


Оптимум рН дріжджовий інвертази знаходиться в досить широкій зоні від 4,0 до 5,5. Фермент інгібується іонами металів. Повний інгібування відбувається під дією ртуті і свинцю; часткове інгібування викликають іони срібла, цинку, міді. ?-Фруктофура-нозідаза гидролизует також рафінозу і метил-?-D-фруктофуранозід, причому, якщо відносну швидкість гідролізу сахарози прийняти за 100, то відповідні швидкості розщеплення цих субстратів дорівнюватимуть 47 і 77.

Інвертаза знаходить широке застосування в харчовій промисловості. Гідроліз концентрованих розчинів сахарози призводить до утворення більш солодких сиропів. Точка кипіння інвертованих сиропів вище, а точка замерзання нижче, т. К. При інверсії підвищується осмотичний тиск. Утворилися при дії інвертази моносахариди більш розчинні, не так легко викристалізовуються з висококонцентрованих сиропів. Практичне використання інвертази в кондитерській промисловості буде розглянуто в розділі 8.3.

?-галактозидази (Н. Ф.3.2.1.23). Фермент, який часто називають лактазой, каталізує реакцію гідролітичного відщеплення Неред-цірующіх залишків ?-D-галактози в ?-галактозидов, зокрема, в молочному цукрі - дисахарид лактози:

Ферментні препарати лактази, що застосовуються в харчовій промисловості, отримують за допомогою різних продуцентів: мікроскопічних грибів (A. oryzae, A. niger), бактерій (Е. coli, Lactobacillus), дріжджів (S. fragilis, S. psedotropicalis). Всі вони мають різні температурні оптимум, які, проте, лежать в межах 37-50 ° С. Оптимум рН цих ферментів також помітно відрізняються: для бактеріальних - близько 7,0; для грибних - близько 5,0; для дріжджовий лактази - близько 6,0.

При гідролізі лактози в цілісному молоці, знежиреному молоці або в концентратах молока оптимальну активність (при нейтральному рН цих субстратів) проявляє дріжджовий фермент; для сироватки і її концентратів - грибний. Причому в знежиреному молоці або сироватці лактоза гідролізується легше, ніж в цілісному, а пастеризовані субстрати гідролізуються легше, ніж непастеризовані.


?-галактозидази з E.coli була отримана в кристалічному стані, її молекулярна маса 850 000 Так. Вона відзначено зниження деякими металами (Сі, Zn). Відновлюючі агенти (цистеїн, сульфід Na, сульфіт Na і ін.) Активують фермент і здатні долати вплив інгібіторів-металів.

У деяких груп населення (виняток становлять жителі Північної Європи і деяких районів Африки) яскраво виражена непереносимість (інтолерантності) лактози, пов'язана з повним або частковим зникненням у дорослих людей лактазной активності в клітинах кишкового епітелію. У грудних немовлят активність цього ферменту дуже висока.

Ендополігалактуроназа (Н. Ф.3.2.1.15) і екзополігалактуроназа (Н. Ф.3.2.1.67). Ці два ферменти беруть участь в перетвореннях пектинових речовин поряд з іншими пектолітіческіх ферментами рослинного і мікробного походження (див. Також гл. 3).

Ендополігалактуроназа - фермент, який гідролізує а-1,4-свя-зи в молекулі розчинної пектину (метоксильованих полігалакту-РОНов кислоти), неврегульованим, довільним чином. Зі зростанням ступеня етерифікації полігалактуронової кислоти ступінь і швидкість гідролізу падають, т. К. Для здійснення каталітичної активності ферменту потрібні вільні карбоксильні групи. Більшість вивчених ендополігалактуроназ мікроскопічних грибів мають молекулярну масу від 30 000 до 40 000 Так. Оптимальні значення рН коливаються в діапозоні 3,8-5,5.

У гідролізі цього типу зв'язку бере участь і інший фермент - екзополігалактуроназа, який послідовно відщеплює молекулу галактуроновой кислоти, починаючи з нередуцирующего кінця. Ендополігалактуроназа синтезується як грибами, так і деякими видами бактерій. Вони відрізняються по своїй специфічності до пектинам з різних джерел, кінцевими продуктами реакції, оптимуму рН і іншим властивостям.

Для промислового виробництва ферментних препаратів пек-толітіческіх ферментів, які є комплексними, як продуцентів використовують в основному мікроскопічні (цвілеві) гриби, зокрема, гриби роду Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактеріальні ферменти в промислових масштабах не виробляються.

Рослинні полігалактуронази, мабуть, схожі на грибні полігалактуронази. Вони виявлені в широкому спектрі плодів і овочів: помідори, авокадо, редисці, огірках, яблуках, грушах, цитрусових та ін. Всі вони проявляють активність при природних рН плодів.


Застосування препаратів пектолітіческіх ферментів в промисловості досить широко. Вони використовуються при виробництві фруктових сокових концентратів і екстрактів, при освітленні соків і вин, при виробництві фруктових і овочевих пюре і нектарів.

Целлюлолітіческіе ферменти. Ферментативне руйнування целюлози та споріднених їй полісахаридів (геміцелюлози, лігніну) - складний процес, що вимагає участі комплексу ферментів. Продуцентами такого комплексу целлюлолитических ферментів є гриби роду Trichoderma, Phanerochaete (Sporotrichum) і Fusarium, a також бактерії роду Clostridium, Cellulomonas і деякі інші.

Три основних типи целлюлолитических ферментів, які продукуються мікроскопічними грибами, утворюють комплекс ферментів, здатних здійснити повний гідроліз целюлози:

-Ендо-1,4-?-глюконази або целюлоза (Н. Ф.3.2.1.4) безладно гидролизует ?-1,4-глікозидні зв'язку. Вона не розщеплює целлобіоза, але
 гидролизует целлодекстріни і похідні целюлози з високою сте-
 пенью заміщення, т. к. специфічність цього ферменту не висока.

-Екзо-1,4-?-глюконази або целлобіогідролаза (Н. Ф.3.2.1.91) діє на целюлозу, отщепляя целлобіозние ланки з нередуцирующего кінця ланцюга. Цей фермент не діє на заміщені похідні цел-
 люлози, що вказує на більш високу субстратне специфічність,
 ніж у ендоглюконази. Целлобіогідролаза гидролизует целлодекстрі-
 ни, але не діє на целлобіоза.

-?-глюкозидази (Н. Ф.3.2.1.21) розщеплює целлобіоза і целлоолігосахаріди до глюкози. Фермент не діє на целюлозу і вищі олігосахариди.

Целлюлазной система бактерій істотно простіше, ніж у грибів, т. К. Бактерії утворюють тільки ендоглюконазу і ?-глюкозидази.

Всі ферменти целлюлолитическую комплексу досить добре вивчені: практично всі вони є гликопротеидами, визначені їх молекулярні маси, ізоелектричної точки, для багатьох показано наявність множинних форм.

Доведено, що різні ферменти, що гідролізують високоупоря-рядкування целюлозу, діють в синергизме (рис. 8.10).

Ендоглюконаза атакує аморфні ділянки целюлозних фібрил. В результаті утворюються нові целюлозні ланцюжка, на які діє целлобіогідролаза, отщепляя целлобіозние ланки з нередуцирующего кінця. Синергізм між двома цими ферментами проявляється в тому, що в результаті дії ендоглюконази з'являється новий субстрат (більш короткі ланцюжки), на який діє вже целлобіогідролаза. ?-глюкозидази підсилює гідроліз, розщеплюючи целлобіоза - кінцевий продукт і інгібітор цих ферментів.


Застосування целлюлолитических ферментів представляє великий інтерес, т. К. Ферментативний гідроліз целлюлозосодержащих матеріалів (деревина, торф, сільськогосподарські і міські відходи) може забезпечити отримання різних біотехнологічних продуктів (глюкози, етанолу, ацетону, мікробної біомаси). В даний час дослідження ферментативного розщеплення целюлози досягли такого рівня, коли є всі необхідні умови для розробки промислового процесу і лише з економічних причин він не реалізується на практиці.


Протеолітичні ферменти (Н. Ф.3.4).Основний реакцією, що каталізує протеолітичнимиферментами, є гідроліз пептидного зв'язку в молекулах білків і пептидів.

Згідно з первинною класифікації протеолітичних ферментів їх ділили на дві групи: протеїнази і пептідази. При цьому вважали, що протеїнази діють на білки, розщеплюючи їх до поліпептидів; поліпептиди ж гідролізуються пептидазами до амінокислот. Пізніша класифікація, досі зберегла своє значення, заснована на схемі, запропонованій М. Бергманом і Д. Фрутоном (1937). Відповідно до цієї схеми протеази поділяються на ендо- та екзопеп-тідази. Ферменти першої групи (ендопептідази) можуть гідролізу-вать глибинні пептидні зв'язку і розщеплювати молекулу білка на більш дрібні фрагменти; ферменти другої групи (екзопептідази) не можуть гідролізувати пептидні зв'язку, що знаходяться в середині ланцюга, і діють або з карбоксильного, або з аминного кінця ланцюга, отщепляя послідовно одну за одною кінцеві амінокислоти. У зв'язку з цим екзопептідазипідрозділяють на амінопептидази, карбоксипептидази і діпептідази.


карбоксипептидази (Н. Ф. 3.4.12) каталізують відщеплення С-кон-цевих амінокислот.


амінопептидази (Н. Ф.3.4.11) каталізують відщеплення N-кінцевих амінокислот.

діпептідази (Н. Ф.3.4.13) виявляють специфічність до діпептідним субстратів.

Разом з тим ендопептідази (Протеїнази) розділені на підгрупи, починаючи з подподкласса 3.4.21, в першу чергу на підставі катали-


тичного механізму (будови активного центру); особливості специфічності використовуються при цьому тільки для ідентифікації індивідуальних ферментів в межах подподкласса:

-серинові протеїнази (Н. Ф.3.4.21), в активному центрі яких функ-
 ціонує залишок серину і гістидину;

- тіоловиє (цистеїнові) протеїнази (Н. Ф.3.4.22), містять в активному
 ном центрі SH-групу залишку цистеїну;

- кислі (карбоксильні) протеїнази (Н. Ф.3.4.23), в активному центрі
 містять СООН-групу залишку аспарагінової кислоти;

-металлопротеінази (Н. Ф.3.4.24), містять в активному центрі метал,
 необхідний для прояву їх каталітичної активності.

Група протеїназ, про механізм дії яких нічого невідомо, віднесена до подподкласса 3.4.99.

Субстратна специфічність протеїназ буде визначатися наступними факторами: природою амінокислоти, що утворює гідролізуемих пептидную зв'язок; радикалами амінокислот, віддаленими від гідролізуючись-мій пептидного зв'язку; загальної просторової конформацией молекули білка, що робить певні пептидні зв'язки доступними для дії ферменту.

Дослідження протеолітичних ферментів ведеться досить інтенсивно. Це відбувається внаслідок того, що вони є надзвичайно зручним об'єктом для вивчення структури білків, активних центрів ферментів, механізмів регуляції ферментативної активності та інших важливих питань ензимології; крім того, протеази широко застосовуються в різних галузях промисловості: харчової, сільському господарстві, медицині.

Промислове застосування препаратів протеаз буде описано в розділі 8.3. Тут же ми зупинимося на розгляді окремих властивостей протеаз, що мають технологічне значення, попередньо розділивши їх по типу походження на рослинні, тваринні і мікробні.

Рослинні протеази. Спори про пріоритетність тих чи інших ферментних препаратів, отриманих з названих джерел, ведуться вже досить довго. Однак, у зв'язку з обмеженістю тваринної сировини (внутрішні органи великої рогатої худоби і свиней), а також можливої ??токсичністю мікробних препаратів (всі вони вимагають високого ступеня очищення, хоча і це не може служити абсолютною гарантією їхньої безпеки), великий інтерес представляють рослинні протеази, позбавлені зазначених недоліків.

папаин (Н. Ф.3.4.22.2) і хімопапаіном (Н. Ф.3.4.22.6). Папаин є найбільш вживаним у виробництві протеолітичних ферментів. Ферменти папаин і хімопапаіном - справжні ферменти латексу плодів динного дерева (Carica papaya).


Ці ферменти відносяться до групи тіолових протеїназ, характерною особливістю яких є те, що вони активуються сульфгідріль-ними сполуками - відновленим глутатионом, цистеїном.

Папаин і хімопапаіном отримані в кристалічному стані; їх молекулярна маса 20 700 і 36 000 Так, відповідно, а ізоелектрічес-кі точки рівні 8,75 для папаина і 10,1 для хімопапаіном.

Оптимальна зона рН для дії папаїну залежить від природи гід-ролізуемого білка і може бути слабокислою, нейтральною або слаболужною.

Хімопапаіном має велику схожість з папаїном, проте можна виділити і деякі цікаві відмінності. Наприклад, активність хімопапаіном при гідролізі гемоглобіну і казеїну в два рази нижче, ніж у папаина; він більш термостійкий, ніж папаин, і проявляє хорошу стабільність в кислому середовищі (рН 2,0).

Папаин володіє досить широкою специфічністю. Він переважно гідролізує другу пептидную зв'язок, що лежить за карбоксильною групою фенілаланіну.

Різні фірми, як зарубіжні, так і вітчизняні, випускають ферментні препарати на основі папаина з різним ступенем очищення. Можливості їх використання обширні: шкіряна промисловість (при Обезволашіваніе і мягченіі шкур); кіновиробництво (для розчинення желатинового шару на плівках при їх регенерації); парфумерія (при створенні добавок в креми, лосьйони, зубні пасти); виробництво синтетичних миючих засобів (для видалення забруднень білкової природи); медицина (при лікуванні запальних процесів, опіків, тромбозів і ін.); харчова промисловість (виноробство, пивоваріння, виробництво спирту, хлібопечення, сироваріння та ін.).

фіцін (Н. Ф. 3.4.22.3) і бромелаин (Н. Ф. 3.4.22.5). Фіцін виділяють з молочного соку фікусових рослин, наприклад, інжиру (Ficus carica). Так само, як і папаїн, він відноситься до тіоловим Протеиназа. Ще один тіоловий фермент - бромелаин - отримують зі свіжого соку ананаса (Bromeliacea).

Обидва ці ферменту мають схожість з папаїном, проявляють найбільшу активність в нейтральній зоні рН, мають широку специфічністю, переважно розщеплюють пептидні зв'язки, утворені позитивно зарядженими амінокислотами.

Використання бромелаина і фіціна аналогічно використанню папаина; в останні роки їх виробництво зросло, і в даний час ці ферменти застосовують для видалення білкової каламуті в пиві і для м'якшення м'яса.

Протеолітичні ферменти насіння рослин. У насінні злакових і бобових культур міститься цілий комплекс протея-


літичних ферментів, які беруть участь в розщепленні запасних білків до амінокислот в процесі проростання насіння. У покояться насінні стан білкового комплексу характеризується високою стабільністю і автолиз в водних суспензіях виражений слабо. Тому комплекс про-теолитическими ферментів насіння залишався довгий час слабо вивченим. Це було пов'язано з методичними труднощами їх виділення і очищення. В даний час відомо, що протеоліз білків в насінні рослин здійснюється комплексом ферментів, що розрізняються за своїми функціями, механізму дії і іншими показниками. Деякі з цих ферментів були виділені у вигляді високоочищених препаратів і детально охарактеризовані. Так, наприклад, з насіння пшениці були виділені кілька типів протеолітичних ферментів, що розрізняються по оптимуму рН: кислі протеїнази з оптимумом рН 3,7 - 4,0; нейтральні протеїнази з оптимумом рН 6,5 -7,0; лужні протеїнази з оптимумом рН 8,0.

З трьох груп протеїназ найбільшої уваги технологів заслуговують нейтральні протеїнази. За активністю вони в кілька разів перевершують кислі і в умовах тесту здатні ефективно розщеплювати білки клейковини. Одна з особливостей нейтральних протеїназ полягає в тому, що вони не розчиняються у водних, сольових і буферних розчинах. Вони міцно пов'язані з білками клейковини комплексу і витягуються при частковому розчиненні клейковини в лужному розчині. Максимальне вилучення нейтральних протеїназ відбувається при обробці подрібненого зерна, борошна або ліофілізованої клейковини 0,35% -м розчином карбонату натрію. При підкисленні лужного розчину нейтральні протеїнази випадають в осад, а в надоса-дочной рідини залишаються їх білкові інгібітори. Таким чином, в дозрілих насінні пшениці нейтральні протеїнази і їх білкові інгібітори утворюють єдиний неактивний комплекс, пов'язаний з клейковиною. Співвідношення активності протеїназ та їх інгібіторів в дозрілому зерні визначає стабільність білкового комплексу, його стійкість в процесі тестоведения.

Нейтральні протеїнази Не активуються відновленим глутатионом або цистеїном і тому не можуть бути віднесені до тіоловим ферментам, на відміну від кислих протеїназ. Нейтральні протеїнази ингибируются хлоридом натрію, фенольні сполуками, ароматичними амінокислотами, продуктами цукрово-аминной реакції (крейди-ноідінамі). Хлорид натрію є обов'язковим компонентом рецептури і, внесений в такій кількості, знижує активність нейтральних протеїназ і відповідно інтенсивність автолиза на 60-70%. Залежно від якості борошна і стану її клейковинного комплексу технолог може варіювати час наповнити контейнер і тим самим ре-


гуліровать інтенсивність протеолізу. При переробці слабкої муки необхідно якомога раніше вводити сіль, тоді як для борошна з надмірно міцною клейковиною бажано активізувати протеолиз, і сіль слід вносити на більш пізніх стадіях.

У зв'язку з цим необхідно ще раз підкреслити важливість вивчення власних ендогенних ферментних систем біологічної сировини, факторів, що впливають на їх активність з точки зору їх величезної ролі в процесах, що відбуваються при дозріванні, зберіганні та переробці харчової сировини.

Протеази тваринного походження. Протеазам тваринного походження належить величезна роль у процесах травлення. Вони були одними з перших ферментів, які отримані в високоочищеним кристалічному стані і детально вивчені. Саме вони стали об'єктами для розшифровки структури активного центру і механізму каталітичної активності. Крім того, ці ферменти, завдяки своїй високій специфічності, самі з'явилися інструментами для розшифровки первинної структури білків, вивчення регу-ляторной функцій протеаз в метаболізмі клітини.

трипсин (Н. Ф.3.4.21.4). Трипсин - серинові протеиназа, отримана в кристалічній формі. Молекулярна маса близько 23 800 Так. З-електрична точка 10,6; оптимум рН дії знаходиться між 7,0-9,0 для білків і синтетичних субстратів.

Трипсин проявляє високу специфічність до певних пептидним зв'язкам. Він здійснює гідроліз пептидних зв'язків, утворених карбоксильними групами аргініну і лізину. Трипсин секретується підшлунковою залозою у вигляді зимогена - тріпсіногена, неактивного попередника, і активується або Ентерокиназа, або аутоката-політично активним трипсином за механізмом обмеженого протеолізу. Перетворення трипсиногена (229 амінокислотних залишку і молекулярна маса близько 24 000 Да) в трипсин (223 амінокислотних залишку) можна представити таким чином: розрив однієї-єдиної пептидного зв'язку між Ліз-Ілі, відщеплення N-кінцевого гексапеп-Тіда Вал-Асп-Асп- асп-асп-Ліз призводить до утворення активної форми ферменту.

Високоочищений трипсин застосовується для медичних цілей. Це одна з головних протеаз підшлункової залози, яка у вигляді неочищеного панкреатину знаходить деякий застосування в харчовій промисловості для виробництва гідролізатів.

хімотрипсин (Н. Ф.3.4.21.1). Хімотрипсин - протеолітичний фермент, що секретується підшлунковою залозою в тонкий кишечник у вигляді неактивного попередника, званого хімотріпсіногеном. Хімо-трипсиноген (молекулярна маса близько 25 000 Да) являє собою по-


ліпептідную ланцюг, що складається з 245 амінокислотних залишків і містить п'ять дисульфідних зв'язків. Він активується в тонкому кишечнику під дією трипсину. При цьому відбувається гідроліз чотирьох пептидних зв'язків і відщеплення двох дипептидов (14-15 і 147-148). В результаті утворюється активний хімотрипсин, що складається з трьох поліпептидних ланцюгів, ковалентно пов'язаних двома дисульфідними містками.

В активному центрі химотрипсина міститься залишок гістидину (57), аспарагінової кислоти (102) і залишок серину (195). Молекулярна маса близько 22 500 Так. Ізоелектрична точка 8,3; оптимум рН в межах 7,0 9,0, що узгоджується з природними умовами його дії.

Специфічність химотрипсина полягає в тому, що він краще гидролизует пептидні зв'язки, утворені ароматичними амінокислотами: тірозіном, триптофан, фенілаланін.

Цей фермент не застосовується в харчовій промисловості як такої, але є складовою частиною комплексних препаратів панкреатину.

пепсин (Н. Ф.3.4.23.1). Пепсин виробляється слизової шлунка у вигляді пепсиногену (молекулярна маса близько 42 000 Да). Пепсиноген перетворюється в активний пепсин під дією НС1 або аутокаталітіческі шляхом розщеплення однієї пептидного зв'язку. Фермент отримано в кристалічному вигляді, його молекулярна маса 35 000 Так, оптимум рН дії 1,8.

Пепсин є кислою (карбоксильної) протеиназой. Його специфічність виражається в переважному гідролізі пептидних зв'язків, утворених амінними групами природних амінокислот.

Пепсин має величезне значення як травний фермент, він входить до складу лікарських ферментних препаратів, тонізуючих засобів, жувальної гумки. У харчовій промисловості пепсин використовують для згортання казеїну молока і для розчинення білкової каламуті в пиві.

реннін (Н. Ф.3.4.23.4). Цей фермент, який має багато спільного з пепсином, міститься в соку четвертого відділу шлунка телят. Реннін утворюється з попередника - проренніна. Його молекулярна маса близько 40 000 Так, ізоелектрична точка близько 4,5. Оптимум рН дії ферменту 3,7.

Реннін являє собою потужну протеазу, яка здійснює згортання молока; він є основним компонентом неочищених екстрактів і комплексних промислових препаратів, які використовуються для цієї мети.

Казеїн молока (78% всіх азотистих речовин молока) є фос-фопротеідом, що містить близько 6-10% вуглеводів. Він не осідає іонами Са+2; дію Реннін призводить до утворення макрогліко-пептиду і пара-?-казеїну. Останній осідає в присутності іонів Са+2 і сприяє осадженню інших фракцій казеїну.

Мікробні протеази. Число мікроорганізмів, які продукують протеази, надзвичайно велике. Специфічність цих ферментів в багатьох випадках більш широка, ніж специфічність добре вивчених ферментів тваринного походження, що ускладнює їх класифікацію.

Мікробні протеази (грибні та бактеріальні) знаходять широке застосування в різних галузях промисловості. Серед них є ферменти, які мають оптимум в нейтральній, кислої і лужної зонах рН; деякі з них виявляють тріпсіноподобних дію, інші є пепсіноподобнимі ферментами, треті - тіоловими, четверті мають пептідазная активність і т. д. Багато з них були виділені у вигляді високоочищених препаратів і детально охарактеризовані.

Найбільше застосування знайшли лужна серинові протеаза з Bacillus licheniformis, яка використовується в миючих засобах; протеаза з Мусог, яка замінила телячі сичуга у виробництві сиру, а також грибна протеаза з A. oryzae (в комплексі з амілазою), яка використовується в хлібопеченні.

Протеази - найбільш важливі промислові ферменти. Рівень споживання препаратів мікробних протеаз близько 40% від всіх використовуваних ферментів (табл. 8.3).

субтілізін Карлсберга (Н. Ф.3.4.21.14). Кристалічна форма цього ферменту вперше була отримана в 1952 р, і з тих пір субтілізін є найбільш важливою промислово використовуваної мікробної проте-азой. Він продукується В. subtilis і В. licheniformis.


Цей фермент складається з однієї поліпептидного ланцюжка (214 амінокислотних залишку), серед амінокислот відсутній цистеїн. Молекулярна маса ферменту - 27 277 Так, ізоелектрична точка 9,4; оптимум рН 8,0-9,0. Фермент відрізняється високою рН-стабільністю в діапазоні від 5,0 до 11,0.

Субтілізін Карлсберга є серинових протеїназ, володіє широкою специфічністю, краще гидролизует пептидні зв'язки, утворені ароматичними амінокислотами.

Ренніноподобние кислі протеази. Найбільш важливі з практичної точки зору кислі протеази, які використовуються при виробництві сирів, утворюють культури Mucor pusillus і Mucor mieher.

Протеази з Mucor pusillus мають молекулярну масу 30 000 Так, складаються з однієї поліпептидного ланцюжка, оптимум рН дії по казеїну 4,5, по гемоглобіну 4,0.

Протеази з Mucor mieher мають велику молекулярну масу 38 000 Так, містять близько 6% вуглеводів і проявляють максимальну активність по гемоглобіну при рН 4,5.

Нейтральні протеази аспергіллових грибів. З куль-тури A. oryzae були виділені дві нейтральні металлопротеінази. Одна з них має оптимум рН 7,0, проте швидко інактивується при 50 ° С. Інша володіє більш низьким оптимумом рН 5,5-6,0, але проявляє високу термостабільність (10 хвилин, 90 ° С - залишкова активність 10%).

Протеази з різних штамів A. oryzae або з одних штамів, але зростаючих при різних умовах, неоднаково впливають на процес хлібопечення навіть в тому випадку, якщо доза ферменту стандартизована. Це пояснюється тим, що промислові препарати містять різні кількості протеолітичних компонентів з A. oryzae, а також впливом різноманітних зовнішніх і внутрішніх факторів на протеоліз білків борошна.

оксидоредуктази | ЗАСТОСУВАННЯ ФЕРМЕНТОВ В ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЯХ


ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТИ | ЗАГАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ | ферментативна кінетика | Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції. | Механізм ферментативної реакції | КЛАСИФІКАЦІЯ І НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ | Борошномельне виробництво і хлібопечення | Виробництво крохмалю та крохмалепродуктів | кондитерське виробництво | Виробництво плодово-ягідних соків, безалкогольних напоїв і вин |

© 2016-2022  um.co.ua - учбові матеріали та реферати