Головна

Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції.

  1. II. Вплив монголо-татарського ярма на розвиток російських земель.
  2. V - швидкість обігу грошей.
  3. А) буде обертатися в тому ж напрямку, в якому бувало колесо, б) швидкість обертання зросте.
  4. А. Вплив на органи репродуктивної системи і молочні залози.
  5. Абсолютна температура. Температура - міра середньої кінетичної енергії молекул. Зв'язок між температурою і енергією, середня квадратична швидкість (визначення).
  6. Автомобілі та Їх Вплив на Відчуття Території
  7. Агрохімічні властивості грунту і їх вплив на ефективність добрив.

Концентрація субстрату є найважливішим чинником, що визначає швидкість ферментативної реакції. Ще в 1902 р В. Анрі при вивченні реакції гідролізу сахарози припустив, що фермент ?-фруктофуранозидази взаємодіє зі своїм субстратом, потім це


з'єднання розпадається, фермент залишається в первісному вигляді, а субстрат сахароза виявляється розщепленої на глюкозу і фруктозу.

 тоді Ks - Константа дисоціації комплексу ES дорівнює відношенню констант швидкостей зворотної та прямої реакції:


Ця пропозиція була в подальшому розвинене Л. Міхаелісом і М. Ментен. У 1913 р вони постулювали наступні рівняння ферментативної реакції:

Виходячи із закону діючих мас, можна записати наступне рівняння:

В ході ферментативної реакції в будь-який момент часу фермент існує в двох формах: вільної та зв'язаної, т. Е. У формі комплексу ES.

Швидкість ферментативної реакції буде максимальною при такій концентрації субстрату, коли весь фермент перейде в комплекс ES, тобто коли всі активні центри насичені субстратом і подальше збільшення концентрації субстрату не призведе до збільшення швидкості

реакції.

Перетворюючи представлене вище рівняння, отримаємо вираз, яке матиме такий вигляд:

Це рівняння названо рівнянням Міхаеліса-Ментен. Воно має величезне значення для вираження залежності дії ферментів від концентрації субстрату. Однак воно містить і ряд недоліків, зокрема, при його виведенні було зроблено кілька припущень, наприклад, не враховувалася друга стадія ферментативної реакції - утворення Е і Р.



У зв'язку з цим було запропоновано низку вдосконалених рівнянь, з урахуванням впливу утворилися продуктів реакції. В даний час найбільш широко використовують рівняння Ходдейна-Бріггса. Воно має такий вигляд:

У цьому рівнянні замість Ks - константи дисоціації комплексу ES, який присутній в рівнянні Міхаеліса-Ментен, варто Кm - константа Міхаеліса (в чисельнику якого знаходяться константи швидкостей реакцій, що ведуть до розпаду комплексу ES в двох напрямках):


Для того, щоб графічна залежність, що виражає вплив концентрації субстрату на початкову швидкість ферментативної реакції, з гіперболічної перетворилася в прямолінійну, що, очевидно, представляє більшу зручність в експериментальній практиці, рівняння Холдейна-Бріггса було перетворено Лайнуівером і Берко за методом подвійних зворотних величин.


величина Кт - це ключовий кінетичний параметр; якщо [S] = Кт, то V = Vmах/ 2, отже, константа Міхаеліса чисельно дорівнює концентрації субстрату (в молях на літр), при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної.

приблизне значення Кт можна отримати простим графічним способом, як це показано на рис. 8.4 а; проте в цьому способі досить велика похибка в знаходженні Vmax. Значно зручніше користуватися прямолінійною залежністю при обробці даних за методом подвійних зворотних величин, рис. 8.4 б. В цьому випадку можна отримати більш точне значення Кт.

Джерелом безлічі непорозумінь як в минулому, так і в сьогоденні, є некоректне використання терміну «константа Міхаеліса» і двох символів КS и Кm для позначення величин аж ніяк не-ідентичних, незважаючи на абсолютно чіткі рекомендації Комісії з ферментам Міжнародного Біохімічного Союзу. перша вели

чину - КS - константа рівноваги, що виражається відношенням Ks= k-1/ k+1,

характеризує спорідненість ферменту до субстрату (або, інакше, міцність комплексу ES), причому існує зворотна пропорційність між величиною Ks і спорідненістю ферменту до субстрату. Друга величина - Кт - відповідає концентрації субстрату, при якій V = Уmax/ 2. часто властивість Ks помилково приписують Кт. Насправді Кт буде мірою спорідненості ферменту до субстрату тільки в тому єдиному випадку, коли величина k+2 буде настільки мала, що Кт практично співпаде з Ks.

Багато ферменти каталізують реакції за участю двох субстратів. До так званих молекулярних реакцій відносяться реакції перенесення хімічних угруповань з одного з'єднання на інше, реакції синтезу, окислювально-відновні реакції.



Такі реакції можуть протікати за двома різними механізмами. У реакціях першого типу, званих реакціями одиничного заміщення, два субстрату А і В утворюють з ферментом комплекс ЕАВ, який потім розпадається з утворенням продуктів реакції С і Д. Другий тип двухсубстратних реакцій протікає за механізмом подвійного заміщення (механізм типу «пінг-понг») . У цих реакціях з активним центром ферменту в кожен момент часу пов'язаний тільки один з двох субстратів.

При дослідженні кінетики молекулярних реакцій концентрацію одного з субстратів залишають постійної (В), а другого - змінюють (А). У цьому випадку в координатах 1 / V від 1 / [А] можна отримати «здається» значення Кт. істинне значення Vтax и КтB отримують при дослідженні декількох концентрацій субстрату В. Точно так само роблять при визначенні КтА (Коли концентрація А постійна, а концентрація В варіюється). Кт по відношенню до різних субстратів в одній і тій же реакції можуть бути різними - це добре видно з такого прикладу.

Реакція каталізується алкогольдегидрогеназой:

Вплив концентрації ферменту на швидкість ферментативноїреакції.

Концентрація ферменту істотно впливає на швидкість ферментативної реакції. При насичує концентрації субстрату, що забезпечує Vmaх початкова швидкість ферментативної реакції бу

дет, в першу чергу, залежатиме від концентрації ферменту. Ця залежність прямопропорціо-нальне, що свідчить про те, що початкова швидкість є мірою кількості ферменту. Графічно це представлено на рис. 8.5.

Мал.8.5. Вплив концентрації ферменту [Е] на швидкість ферментативної реакції (Vo)


Вплив температури на активність ферментів.Загальний вигляд кривої, що характеризує вплив температури на активність ферменту, можна представити у вигляді графіка, зображеного на рис. 8.6.

Оптимальна температура, при якій спостерігається максимальна активність, для більшості ферментів знаходиться в межах 37-50 ° С, але деякі ферменти мають температурний оптимум за межами цієї зони.

Вплив температури на активність ферменту, яке може бути легко вивчено експериментально, має дуже складний характер, так як обумовлено цілою низкою чинників, а саме:

- Впливом температури на швидкість розщеплення комплексу ES на вільних

ний фермент і продукт реакції, т. е. на константу швидкості реакції к+2;

-Вплив температури на спорідненість ферменту до субстрату, тобто на
 константи k-1 и k+1;

-Вплив на теплоту іонізації, а, отже, на процеси иони-
 зації всіх компонентів реакції: самого ферменту, субстрату, про-
 проміжних і кінцевих продуктів реакції;

-Вплив на освіту таких з'єднань, як «фермент-активація
 тор »або« фермент-інгібітор »;

-Вплив на процес денатурації ферментного білка.

Відоме рівняння Арреніуса, що характеризує вплив температури на швидкість хімічної реакції, може бути докладено до лівої частини температурної кривої (див. Рис. 8.6):

Зміна швидкості ферментативної реакції при підвищенні температури вимірюється температурним коефіцієнтом Q10, Який показує, у скільки разів прискорюється дана реакція при підвищенні температури на десять градусів. Можна перетворити рівняння Арреніуса, підставивши в нього коефіцієнт Q10:


Це рівняння дає можливість визначити енергію активації шляхом визначення значень Q| 0 для даної ферментативної реакції.

Для звичайних хімічних реакцій Q10 = 2-3, для ферментативних реакцій (ліва частина температурної кривої) Q10 = 1-2, причому значення Q| 0= 1 характерно для температур, близьких до оптимальних.

Права частина температурної кривої показує різке зниження швидкості ферментативної реакції при температурах, що перевищують оптимальну. І це залежить, в першу чергу, від денатурації ферментного білка. Тому дуже важливим показником, що характеризує відношення ферменту до температури, є його термостабільність.

Термостабільність ферменту складається ніби з двох критеріїв: величини температури і часу її впливу на фермент. Крім того, на термостабільність різних ферментів можуть впливати і такі чинники, як рН середовища, її сольовий склад, захисну дію субстрату.

Вплив рН на активність ферментів.Для кожного ферменту характерна певна вузька область значень рН, при якій він проявляє максимальну активність.

Форма кривих, що описують залежність активності ферменту від рН, відображає здатність важливих для даного ферменту протон-донор-них або протон-акцепторних груп в активному центрі ферменту переходити в стан з необхідним ступенем іонізації при певних значеннях рН (див. Рис. 8.7).

Крім впливу рН на стан іонізації активного центру ферменту, хід представлених кривих буде залежати і від інших факторів. Зокрема, зміна рН середовища змінює стан іонізації субстрату (якщо це заряджену речовину), комплексів ES і ЕР, в деяких, наприклад, окисно-відновних реакціях, іони Н+


самі можуть брати участь в реакції; крім цього, швидкість денатурації ферментативного білка залежить від рН.

При експериментальному вивченні активності ферменту від рН слід пам'ятати, що рН-оптимум залежить від складу середовища (від природи використовуваного буфера); оптимум рН прямий і зворотної реакції можуть бути абсолютно різними; при дії одного і того ж ферменту на різні субстрати рН-оптимум також можуть бути різними. Крім поняття оптимуму рН, дуже важливим є поняття рН-ста-більності. Це той діапазон рН, при якому фермент або ферментативний препарат зберігає свою активність протягом певного періоду часу. рН-Стабільність також залежить від ряду факторів, серед яких, крім уже названих, форма ферментного препарату, ступінь його очищення і ін.

Все вище сказане дозволяє стверджувати, що варіюючи температурний режим і змінюючи рН, можна в якійсь мірі регулювати каталітичну активність ферменту.

Вплив активаторів та інгібіторів.Активаторами називають речовини, які підвищують активність ферментів. Хорошим прикладом таких з'єднань є амінокислота цистеїн і відновлений глутатіон, що містять вільну SH-групу. Їх підвищення продуктивності лікарських полягає в тому, що вони відновлюють дисульфідні зв'язку з утворенням SH-груп, необхідних для здійснення каталітичної активності тіолових ферментів. Крім того, деякі ферменти активуються металами, які або беруть участь в побудові активного центру, або стабілізують просторову конформацію ферментного білка і тим самим забезпечують прояв каталітичних функцій.

Інгібіторами називають речовини, специфічно знижують активність ферментів. Зниження або повна втрата активності ферментів можуть бути викликані різного роду денатуруючих впливів, в цьому випадку правильніше вживати термін «інактивація» ферменту.

Механізм дії інгібіторів може бути найрізноманітнішим:

інгібітор взаємодіє з апоферментом, при цьому можливі
 такі варіанти, як зв'язування функціональних груп білка, зраді
 ня третинної і четвертинної структури апофермента, специфічне
 зв'язування з певною ділянкою апофермента, неспецифічна
 адсорбція на білку;

інгібітор утворює комплекс з субстратом;

інгібітор пов'язує кофермент;

інгібітор пов'язує активатор;

інгібітор пов'язує кофактор.




Найчастіше інгібітор взаємодіє з ферментом, утворюючи комплекс. Це можна виразити таким рівнянням:

Константа дисоціації комплексу фермент-інгібітор (або константа інгібування) Кi визначається виразом:

Кi прямо пропорційна концентрації ферменту і інгібітору і обернено пропорційна концентрації комплексу фермент-інгібітор.

Існує інгібування двох основних типів: необоротне і оборотне. Теоретично, в разі незворотного інгібування k-1 = 0, тобто комплекс EI настільки міцний, що абсолютно не дисоціює. Але для більшості необоротних інгібіторів величина
k-1 хоча і дуже мала, але не дорівнює нулю.

Оборотне інгібування, в свою чергу, буває конкурентним і неконкурентним.

Конкурентний інгібітор конкурує з субстратом на основі структурного подібності, зв'язуючись з активним центром ферменту з утворенням неактивного комплексу фермент-інгібітор. Відмітна особливість конкурентного гальмування полягає в тому, що його можна усунути або послабити, підвищивши концентрацію субстрату. Конкурентний інгібітор знижує спорідненість ферменту до субстрату, отже, величина Кm в присутності конкурентного інгібітора збільшується.

Графічно це виглядає так, як зображено на рис. 8.8.


При неконкурентном гальмуванні інгібітор пов'язується не з активним центром ферменту (тобто не там, де приєднується субстрат), а з іншою ділянкою молекули ферменту. Очевидно, що в цьому випадку інгібітор не робить вплив на величину константи Міхаеліса Кт, але буде знижувати максимальну швидкість реакції - Vmax..

Графічно це можна зобразити таким чином (див. Рис. 8.9):

Одними з найпоширеніших неконкурентних інгібіторів є аллостерічеськіє інгібітори. Приєднуючись ні до активного, а до іншого, так званого аллостеріческому центру молекули ферменту, інгібітор викликає конформаційні зміни в структурі активного центру, внаслідок чого стає неможливим утворення комплексу фермент-субстрат.

Вивчення взаємодії ферментів з інгібіторами і активаторами ферментів дозволяє отримувати цінні відомості про субстратної специфічності ферментів, природою функціональних груп активного центру, механізми каталітичної активності.

Так як в якості інгібіторів можуть виступати кінцеві продукти реакції, різні проміжні продукти метаболізму, немає сумніву в тій величезній ролі, яку виконують інгібітори в регуляції ферментативної активності.

Це підтверджує і факт широкого поширення інгібіторів білкової природи (див. Гл. 2). Крім того, за принципом специфічного інгібування діють багато лікарських препаратів, антибіотики, токсичні речовини, антіаліментарние фактори харчування.

Специфічні інгібітори, що зустрічаються в харчовій сировині та харчових продуктах, присутні в якості складових як в традиційних рецептурах, так і в складних композиційних складах но


вих, модифікованих продуктів харчування. Тому не можна не враховувати їх вплив на активність окремих ферментів і на біохімічні процеси в цілому, що протікають при зберіганні і переробці харчової сировини.

Все це зайвий раз говорить про безліч складних проблем, які зустрічаються в експериментальній роботі з ферментами і використанні ферментних препаратів на практиці.

ферментативна кінетика | Механізм ферментативної реакції


ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТИ | ЗАГАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ | КЛАСИФІКАЦІЯ І НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ | оксидоредуктази | гідролітичні ферменти | ЗАСТОСУВАННЯ ФЕРМЕНТОВ В ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЯХ | Борошномельне виробництво і хлібопечення | Виробництво крохмалю та крохмалепродуктів | кондитерське виробництво | Виробництво плодово-ягідних соків, безалкогольних напоїв і вин |

© 2016-2022  um.co.ua - учбові матеріали та реферати