загрузка...
загрузка...
На головну

Вектори для перенесення ДНК в клітини тварин і рослин

  1. Адаптації до посушливих умов у рослин і тварин
  2. Алгоритм забору мокротиння на атипові клітини.
  3. АНОМАЛІЇ У СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ ТВАРИН, обумовлене мутацією генів
  4. Ареали морських тварин і рослин. Релікти фауни.
  5. Білки тварин, які беруть участь в NER
  6. Вагітність починається з моменту запліднення сперматозоїдом дозрілої яйцеклітини. Вагітність є природним фізіологічним станом.
  7. Біологічна обумовленість онтогенезу поведінки тварин

Всі основні принципи, які використовуються при конструюванні бактеріальних векторів, можна застосувати й для отримання векторів еукаріотів. Як і в випадку бактерій, еукаріотичний вектор являє собою невелику молекулу ДНК, здатну автономно реплицироваться в клітинах тварин. Крім послідовностей нуклеотидів, що забезпечують реплікацію, еукаріотичні вектори можуть містити гени, які використовуються в якості селектіруемих маркерів, а також один або кілька унікальних сайтів рестрикції, за якими проводиться вбудовування клонованих послідовностей нуклеотидів ДНК. Оскільки безпосереднє клонування рекомбінантних ДНК в клітинах тварин було б дорогої і малоефективною процедурою, еукаріотичні вектори використовують, як правило, для отримання експресії вже клонованих послідовностей нуклеотидів в клітинах тварин і рослин, а сам процес клонування проводять в бактеріях. Отже, еукаріотичні вектори, крім усього іншого, повинні бути човниковими векторами. Для експресії в клітинах рекомбінантні ДНК поміщають під контроль регуляторних елементів, відомих і використовуваних ферментативними системами еукаріотів.

На відміну від бактерій в клітинах еукаріот позахромосомних, автономно реплікується генетичні елементи типу бактеріальних плазмід зустрічаються рідко. Тому при конструюванні векторів, здатних реплицироваться і здійснювати експресію в клітинах тварин, найчастіше використовують регуляторні генетичні елементи вірусів тварин або, в залежності від завдань, еукаріотичних генів домашнього господарства, а також генів, для яких характерна тканеспеціфіческіе експресія.

Експресуючий вектор pKSV-10. Структура теоретично можливого еукаріотичного вектора для експресії клонованих генів в клітинах тварин представлена ??на рис. II.12, з якого видно, що еукаріотичний вектор зберігає всі основні генетичні елементи бактеріальних векторів. Це, перш за все, реплікатор (область почала реплікації ori), Розпізнається реплікативного системами еукаріотичної клітини. У ролі репликатора найчастіше використовують відповідні послідовності нуклеотидів вірусів тварин (наприклад вірусу SV40 або вірусу Епштейна-Барр). Особливістю функціонування такого репликатора є потреба в вірусних білках для ініціації реплікації. Так, в разі SV40 - це T-антиген, тоді як у вірусу Епштейна-Барр - білок EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen). Для того щоб реплікація векторів, в яких використані вірусні реплікатори, здійснювалася без вірусу-помічника, отримали спеціальні лінії клітин, які стабільно продукують відповідні вірусні білки. Наприклад, в клітинах лінії COS синтезується T-антиген вірусу SV40, а клітини лінії Hep-EBNA-2 експресують ген EBNA.

Мал. II.12. Еукаріотичний вектор pKSV-10

Частина бактеріальної плазміди, що містить область почала реплікації ori, З'єднана з транскрипционной одиницею вірусу SV40, 5'-кінцева частина якої включає ранні промотор і реплікатор вірусу SV40, а 3'-кінець містить сайт поліаденілювання і інтрон великого T-антигену. Послідовності чужорідної ДНК, які необхідно експресувати в клітинах тварин, клонують по BglII-сайту рестрикції. Крім того, в векторі є унікальні сайти для рестриктаз KpnI, BamHI, SalI і EcoRI. Вектор може реплицироваться в клітинах E. coli і в клітинах мавп лінії COS

У ряді випадків гени, необхідні для реплікації еукаріотичного вектора, вводять безпосередньо в вектор. Так само як і бактеріальний, еукаріотичний вектор повинен містити один або кілька унікальних сайтів рестрикції для клонування необхідної послідовності нуклеотидів. У Експресується векторі полілінкера розташовують безпосередньо за генетичними елементами, що регулюють транскрипцію (найбільше значення з них мають промотор і енхансер), перед сайтом поліаденілювання і термінатором транскрипції. Структура інших касет генів, які забезпечують експресію рекомбінантних генів в клітинах тварин, буде розглянута в розділі 7.4.6.

вектори рослин. Специфіка векторів для експресії рекомбінантних генів в клітинах рослин обумовлена ??головним чином регуляторними послідовностями нуклеотидів, які забезпечують ефективну транскрипцію генів в рослинних тканинах. Наприклад, у відомому векторі pCaMVCAT використовуються промотор і сайт поліаденілювання генів вірусу мозаїки цвітної капусти, під контролем яких перебуває ген бактеріальної хлорамфеніколацетілтрансферази (cat). Цей ген-репортер застосовується для оптимізації умов введення векторної ДНК в клітини рослин і може бути замінений на будь-який інший ген. Вектор pCaMVCAT є човниковим, тобто може реплицироваться як в клітинах E. coli, так і рослин. У першому випадку селектіруемих маркером служить, як зазвичай, ген стійкості до ампіциліну.

Вектор pCaMVCAT належить до великої групи так званих DMGT-векторів (DNA-mediated gene transfer), які здійснюють опосередкований ДНК перенесення генів у клітини рослин. Це означає, що в даному випадку перенесення генів у клітини рослин опосередкований ДНК вектора, так як вони знаходяться в складі векторної молекули. Для отримання стабільних ліній рослинних клітин, які б містили рекомбінантні ДНК в інтегрованому в хромосоми стані і активно експресували його, часто до складу DMGT-векторів вводять додаткові селектіруемих маркери, які надають клітинам, які ввімкнули екзогенну ДНК, певний, легко виявляється фенотип. Такими маркерами можуть бути, наприклад гени неоміцинфосфотрансферази II (NPT II), гігроміцінфосфотрансферази (HPT), дигідрофолатредуктази, в результаті експресії яких клітини набувають стійкості до канаміцину, гігроміціну B або метотрексату відповідно.




ДНК і РНК-лігази | Ферменти матричного синтезу ДНК і РНК | Частота помилок при синтезі ДНК, що здійснюється термостабільними ДНК-полімерази in vitro при проведенні ПЛР в оптимальних умовах | інші ферменти | вектори | Плазмідні вектори | Вектори на основі фага l | Косміди і фазміди | Надмісткі вектори YAC, BAC і PAC | Інтегрують і човникові (бінарні) вектори |

загрузка...
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати