Головна

Біомолекул І КЛІТИН

  1. АВТОМАТИЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ КЛІТИН КРОВІ
  2. розподіл клітин
  3. ДНК-глікозілази і ендонуклеази клітин мікроорганізмів і людини, які беруть участь в BER
  4. Ж) Проблема пошкодження зародкових клітин
  5. Зміна морфології клітин крові при дозріванні
  6. Квантовомеханічна ОСОБЛИВОСТІ БУДОВИ біомолекул

4.1. Основи спектроскопії. Відомо що видиме світло, лише мала частина спектра електромагнітних випромінювань, Чиї взаємно перпендикулярні електрична і магнітна компоненти, періодично міняються місцями. Тому енергію кванта (?), частоту (?) і довжину їх хвиль (?) об'єднують жорсткі залежності (рис. 4.1). Відповідно до них, електромагнітний спектр умовно ділять на частково перекриваються діапазони, Частково залежні від джерела випромінювань. Так, немає принципової різниці між хвилями однієї і тієї ж довжини в ІК і мікрохвильовому діапазонах. Але, їх називають ІК-променів при генерації тепловим приладом і відносять до мікрохвиль, якщо він електронний.

Мал. 4.1. Схема шкал електромагнітного спектра

З блок-схеми (рис. 4.2) видно, що незалежно від діапазону, все спектрометри включають, т. Н. оптопару: 1. джерело монохромного випромінювання енергії з довжиною хвилі X і 2. його приймач = детектор, Що перетворює сигнал в електрострум індикатора.

 
 Мал. 4.2. Принципова схема однопроменевих спектрометрів

Третю складову - кювету з досліджуваним зразком (3) розміщують між ними, зіставляючи потоки енергії випромінювача Фо і детектора Ф1, Для отримання інформації про структуру і властивості об'єкта досліджень. Так вдалося виділити 2 класу спектрів: емісії = Випускання і абсорбції = Поглинання. Відомо, що за законом Г. Кірхгофа (1859) - будь-яка речовина хорошопоглощает випромінювання саме тих ?, які саме випускає. У свою чергу, кожен клас випромінювань поділяють на безперервні = суцільні, смугасті і лінійчатих спектри.

Емпіричні дані І. Ньютон (1666), Й. Фраунгофер (1814) і ін. І закон взаємозв'язку спектрів поглинання і випускання, дозволили Г. Кірхгофа і Р. Бунзену відкрити найважливіший закон фізичної оптики: кожен атом (Функціональна група, молекула, кристал) випускає характерний лінійчатий спектр електромагнітних хвиль. На цій основі була створена теорія характеристичних спектрів, дозволила відкрити He, Rb, і ін. хімічні елементи, а в ХХ ст. - Зробити прилади і методи спектрального аналізу універсальним інструментом вивчення законів існування Всесвіту (табл. 4.1).

Таблиця 4.1

Характеристика основних діапазонів електромагнітного спектра

Продовження таблиці 4.1

Стосовно до хімії і біології важливо, що енергія квантів випромінювань з ? <1 нм, руйнує атомні ядра і хімічні зв'язки, тоді як у хвиль довжиною> 1000 Нм, недостатньо енергії для змін молекулярної структури речовини. Тому основою ідентифікації речовин стали ІК і, рідше УФ діапазони. А в основу фоторецепції клітин і організмів, ліг еволюційний відбір молекул барвників і зорових фотопигментов, здатних при поглинанні квантів випромінювань проміжної області, максимально змінювати орбіталі електронів, що беруть участь в утворенні сполучених подвійних зв'язків.

Як сказано вище, поняття світло відносять до області електромагнітних хвиль в діапазоні 10-8-10-6 М (рис. 4.3). Людина і інші

ссавці бачать лише в невеликої частини спектра, відповідно довжинах хвиль 380 - 800 нм. Але, люди з віддаленим хруcталіком, сприймають УФ-діапазон, як і комахи, яких залучають, непоказні для ссавців квіти. При тому відомо, що птахи - не бачать в синій області спектра, ряд плазунів сприймає ІК промені, а кажани і дельфіни користуються ультразвукової ехолокацією.

Мал. 4.3. Видима область спектра для ссавців

Фотометричний аналіз - сукупність методів якісного і кількісного аналізу за інтенсивністю УФ, видимого та ІЧ випромінювань. Але, т. К. Біооб'єкти на 2/3 складаються з води, висока теплоємність якої поглинає ІК промені, то в біології їх майже не застосовують, широко використовуючи 2 інших діапазону (рис. 4.4).

Мал. 4.4. Схема методів фотометрії (по http://www.krugosvet.ru/ articles / 23/1002315 / 1002315a1.htm)

Нерідко фотометрію зводять до молекулярно-абсорбційному аналізу, заснованому на об'єднаному законі світлопоглинання Бугера-Ламберта-Бера. Згідно з ним, в стандартних умовах кюветного відділення і довжини хвилі, перпендикулярної товщині шару однорідного середовища (l), між концентрацією (С) поглинає речовини і співвідношенням інтенсивностей вихідного = Ф0 і досяг детектора = Ф1 потоків випромінювань, виникає логарифмічна залежність: С = lg Ф0/ Ф1. Звідси з'явився не дуже точний, але поширений синонім - концентраційний аналіз.

При стандартних ? і товщині зразка, кількість світла досягла фотодетектора висловлюють лінійної шкалою світлопропускання = Т (transition), яку для зручності в роботі, звичайно градуируют в%. На жаль, вона не має прямого відношення до властивостей зразка, послабляє інтенсивність випромінювань за рахунок поглинання = А (absorbtion) або, таких застарілих понять, як оптична щільність = D (density) розчину і коефіцієнт його екстинкції = Е. З іншого боку, залежність 2 - lg T = А, забезпечує високу точність вимірювання концентрацій в діапазоні 0,2-0,8 безрозмірною логарифмічною шкали від 0 до ?.

Щоб уникнути оптичних ефектів, здатних спотворити результати, фотометрію проводять в закритих кюветноє відділення фотометров, а тендітні кювети з плоскопараллельнимі стінок - бережуть від падінь, подряпин, патьоків і крапель. З тієї ж причини, не можна торкатися руками оптичних стінок кювет, А після вживання - їх ретельно миють з милом і зберігають в дистилляте, висушивши перед наступним виміром. Щоб кювети не запітніли, їх заповнюють розчинами кімнатної температури до рівня, при якому потік світла цілком проходить через розчин.


Таблиця 4.2

Порівняльна характеристика фотометров

У таблиці 4.2 представлені найважливіші експлуатаційні характеристики однопроменевих фотометров, призначених для вимірювань в УФ і видимій областях спектра. Так як у колориметрів вони набагато простіше, то і вартість їх нижче, приблизно на порядок. Спектрофотометрія в УФ діапазоні дозволяє: 1) ідентифікувати речовини за їх характерним спектрах поглинання; 2) при стандартній довжині УФ променів вимірювати в 1 М водних розчинах багатьох речовин, їх найважливішу спектральную характеристику - молярний коефіцієнт поглинання (Табл. 4.3). Цей неразрушающий метод дозволяє економити препарат, зводячи вимір концентрацій до виміру спектральних максимумів поглинання біомолекул. Аналогічно, рутинні вимірювання активності ферментів спрощують до т. Зв. тесту Варбурга, визначаючи в стандартних умовах, приріст або спад 1 мкмоль НАДН (НАДФН).


Таблиця 4.3

Розрахунок концентрацій біомолекул по їх спектральним

характеристикам УФО

Так як більшість речовин поглинає видиме світло незначно, то забарвлені продукти, в кількості, пропорційній концентрації вихідної речовини, отримують з них після певних фізико-хімічних впливів, включаючи якісні реакції. Цей прийом широко застосовують для доолоріметріі у відносно простих Фотоелектроколориметр = ФЕКах. З біомолекул, так визначають концентрації ортофосфата = неорганічний фосфат (Фн) і інших фосфоорганіческіх з'єднань, заліза, сечовини, білірубіну, холестерину, жирних кислот, білка, гемоглобіну та ін. До недавніх пір, мириться з недоліками, так само визначали глюкозу, фруктозу, крохмаль, глікоген і ін. цукру, поки колориметрію вуглеводів витіснили ферментні і електрометричні методу аналізу.

При колориметрии, досліджуваний розчин порівнюють з поглинанням: 1. контрольного зразка і 2. проб стандартного ряду = шкали порівнянь або графіка калібрування. В якості контролю зазвичай використовують розчинник або розчин з усіма компонентами, крім досліджуваного речовини. Навпаки, щоб концентрація аналізованого речовини пропорційно спадала в 3 - 5 паралельних пробах шкали порівнянь, її готують розведенням розчину точної концентрації, з урахуванням чутливості конкретного методу, температури середовища і часу розвитку забарвлення. Результати колориметрии проб шкали порівнянь оформляють у вигляді графіка залежності інтенсивності забарвлення (вісь ординат) від концентрації аналізованого речовини (вісь абсцис), домагаючись його прямолінійності. За рідкісними винятками, отриманий графік не можна екстраполювати за межі експериментальних точок. Оптимізуючи розмір кювет потрібно прагнути, щоб значення А каліброваного графіка вклалися в інтервалі 0,1 - 1,0, а ще краще - 0,1 - 0,6.

Так як всі ФЕКі розрізняються ступенем монохроматізаціі світла і, відповідно, чутливістю, неприпустимо користуватися калібрувальним графіком або таблицею співвідношень А і С, побудованими для інших ФЕКов! Більше того, калібрування, побудовані з реактивами різних партій, як правило, не збігаються. Тому при зміні реактивів, графік доводиться будувати заново. Після вимірювань абсорбції в дослідних пробах, концентрації аналізованого речовини в них визначають відповідно до калібрувальним графіком або таблицею, з урахуванням обсягу досліджуваного розчину. Якщо величина А проби виявиться вище наявних значень графіка (таблиці), щоб уникнути перекручування результатів, розбавляти реакційну суміш для повторної колориметрии не рекомендується. У цих випадках, краще повторити колориметрический тест з меншим обсягом досліджуваного матеріалу, щоб його результати потрапили на калібрування.

додаткова література

4.2.1. Спектроскопічні методи досліджень в фізіології і біохімії. - Л .: Наука, 1987. - 204 с.

4.2.2. Фізико-хімічні методи молекулярної біології. - М .: Изд-во Моск. ун-ту., 1978. - С. 65 - 95; 127 -173.

4.2.3. Бурштейн Е. А. Люмінесценція білкових хромофоров. - М .: ВІНІТІ «Підсумки науки і техніки». Серія біофізики. - Т. 6, 1976. - 216 с.

4.2.4. Черницький Е. А. Люмінесценція і структурна лабільність білків в розчині і клітці. - Мінськ .: Наука і техніка, 1972. - 280 с.

4.2.5. Еккерт Р. і ін. Фізіологія тварин. - М .: Світ, 1991. - Т. 1. Фоторецептори. - С. 239 - 250.

4.2.6. Лакович Дж. Основи флуоресцентної спектроскопії. - М .: Світ, 1986. - 496 с.




Біохімія та молекулярна біологія | КЕМЕРОВО 2007 | МОЖЛИВІ ТЕМИ РЕФЕРАТІВ | ПРАВИЛА ВИЖИВАННЯ В ЛАБОРАТОРІЇ | Завдання на будинок | Фізико-хімічні властивості і роль води в біосфері | експериментальна частина | Завдання на будинок | АНАЛІЗУ РОЗЧИНІВ | експериментальна частина |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати