Головна

Молекулярно-генетичний метод

  1. I метод.
  2. I. Методика бухгалтерського обліку
  3. I. МЕТОДОЛОГІЯ
  4. I. ОРГАНІЗАЦІЙНО-МЕТОДИЧНИЙ РОЗДІЛ
  5. II метод.
  6. Ii. Методики зовнішньої іммобілізації
  7. II. Методичні вказівки для студентів по виконанню індивідуальних завдань

Молекулярно-генетичний метод - виявлення змін в певних ділянках ДНК, гена або хромосоми. В його основі лежать сучасні методики роботи з ДНК або РНК, В 70-80 рр. в зв'язку з прогресом в молекулярної генетики та успіхами у вивченні геному людини молекулярно генетичний підхід знайшов широке застосування,

Початковим етапом молекулярно-генетичного аналізу є отримання зразків ДНК або РНК. Для цього використовують геномної ДНК (вся ДНК клітини) або окремі її фрагменти. В останньому її випадку, щоб отримати достатню кількість таких фрагментів, необхідно, ампліфікувати (розмножити) їх. Для цього користуються полімеразної ланцюгової реакцією - швидким методом ферментативної реплікації певного фрагмента ДНК. З його допомогою можна ампліфікувати будь-яку ділянку ДНК, розташований між двома відомими послідовностями.

Аналізувати величезні молекули ДНК в тому вигляді, в якому вони існують в клітці, неможливо. Тому перш їх необхідно розділити на частини, обробити різноманітними рестріктазамі - бактеріальними ендонуклеаза. Ці ферменти здатні розрізати подвійну спіраль ДНК, причому місця розрізу строго специфічні для даного зразка. Розщеплення ДНК рестріктазамі дає характерний набір фрагментів (4-6 пар основ), що відрізняються по довжині.

Фракціонування фрагментів ДНК за розміром і довжині проводиться за допомогою електрофорезу на поверхні агарозного або акріламідного гелю. Під дією електричного поля фрагменти ДНК починають переміщатися вниз по гелю зі швидкістю, яка залежить від їх довжини. В результаті кожен фрагмент ДНК займає певне положення у вигляді дискретної смуги в конкретному місці гелю. Довжину кожного фрагмента можна визначити шляхом порівняння відстані, пройденого їм і стандартним відрізком ДНК.

Молекулярно-генетичну діагностику спадкових хвороб використовують і для вивчення геному людини. Щоб виявити необхідні для цього специфічні фрагменти ДНК, використовують блот-гібридизацію по Саузерну. Сутність цієї методики полягає в наступному: спочатку здійснюють денатурацію ДНК з утворенням одно- ланцюгових фрагментів, які переносять на нітроцелюлозні або нейлоновий фільтр в буферному розчині.

Агарозній гель з фрагментами ДНК поміщають на фільтрувальний папір, змочену концентрованим солоним розчином. На гель накладають нітроцелюлозний фільтр, а зверху поміщають суху фільтрувальну папір, в яку вбирається солоний розчин. ДНК переноситься разом з розчином, але затримується фільтром і практично повністю виявляється на його поверхні. Потім одне-ланцюгові ДНК фіксують на фільтрі. Розташування фрагментів на фільтрі точно відповідає їх розташуванню в гелі

Щоб виявити потрібні фрагменти проводять гібридизацію ДНК з реактивним ДНК-зондом або клонують фрагментом ДНК. Нуклеотидная послідовність зонда повинна бути повністю або частково комплементарна досліджуваному ділянці геномної ДНК.

Результат гібридизації комплементарних ланцюгів радіоактивного ДНК-зонда і фрагмента ДНК виявляють за допомогою радиоавтографии: кожна компліментарний зонду послідовність ДНК проявляється у вигляді радіоактивної смуги.

За допомогою методу Саузерн можна скласти рестрикційну карту геному в ділянці досліджуваного генома і встановити, чи несе даний ген будь-які дефекти. Так, розроблені ефективні методи синтезу штучних ДНК-зондів, які використовуються в ренатальной діагностиці спадкових захворювань. Для цього з ембріональних клітин, що містяться в амніотичної рідини плода, виділяють ДНК і гібрідізіруют її за допомогою Саузерн-блотингу з радіоактивним ДНК-зондом. Аномальний ембріон легко розпізнається, тому що його ДНК буде гибридизоваться тільки з ДНК-зондом, комплементарним мутантною послідовності

В даний час існують різні методи виявлення мутацій. Їх ділять на прямі і непрямі. Пряма діагностика мутацій включає ряд методів:

1.Визначення нуклеотидної послідовності, що дає можливість виявити заміни підстав, делеции і вставки в досліджуваному фрагменті.

2.виявлення порушення місця рестрикції, за допомогою блот - гібридизації по Саузерну. Близько 50% нуклеотидних замін веде до зміни місця рестрикції. Це робить можливим виявити мутацію шляхом рестріктного аналізу.

3.Проведення аллелоспеціфіческой гібридизації з синтетичними зондами, що дозволяє виявити мутації в ДНК генома. Послідовність підстав в зонді може бути завдання по дефектному або нормальному варіанту гена. В обох випадках зонд використовується для гібридизації з фрагментами ДНК обстежуваного індивіда.

4.Хімічне і ферментативне розщеплення ДНК в місцях неправильної зшивання підстав виявляє велику групу мутацій, що ведуть до нестабільності ДНК. Метод полягає в електрофорезі двох цепочечной ДНК в нейтральному або рівномірно денатурує гені.

5.Реєстрація зміни електрофоретичної молекули ДНК.

6.Трансляція білкового продукту здійснюється в системі in vitro на основі отримання специфічної мРНК з додаванням лизата ретикулоцитів. Синтезується білок аналізують за допомогою електрофорезу. Зміна рухливості білка вказує на наявність мутації.

До непрямого виявлення мутацій вдаються в тих випадках, коли нуклеотидная послідовність гена ще не розшифрована, але відомо її положення на генетичній карті. Технічні прийоми такі ж, як і в прямій діагностиці, але додається математичний аналіз.

9. Видиме будова хромосом людини і їх морфологія. Класифікація і тонка структура хромосоми

При аналізі метафазних пластинок в світловому мікроскопі можна розрізнити, що кожна хромосома складається з двох плечей і центромери, або первинної перетяжки, яка виконує функцію механічного центру хромосоми під час ділення (малюнок). Центромера є областю хромосоми, до якої при діленні клітини прикріплюється нитка веретена поділу, розводяща хромосоми до полюсів клітини. Крім первинної перетяжки деякі хромосоми мають вторинну перетяжку, не пов'язану з процесом прикріплення ниток веретена. Місцезнаходження вторинної перетяжки в хромосомі пов'язано з утворенням ядерця, а ця ділянка хромосоми називають ЯДЕРЦЕВОГО організатором. Довге плече хромосоми позначається латинською буквою «q», короткий - «р».

Кінцеві ділянки хромосом мають сегменти, що перешкоджають склеюванню хромосом своїми кінцями, і тим самим сприяють збереженню їх цілісності. Ці сегменти були названі теломерами.

Деякі акроцентріческіе хромосоми мають так звані супутники - ділянки, з'єднані з іншою частиною хромосоми тонкою ниткою хроматину.

Малюнок - Схематичне зображення хромосоми

Такі хромосоми називають спутнічковимі. Розмір супутника щодо довжини всієї хромосоми постійний для кожної конкретної хромосоми. У каріотипі людини супутники є у п'яти пар хромосом: у 13, 14, 15, 21 і 22-й.

Класифікація і номенклатура рівномірно забарвлених хромосом людини вперше були прийняті на міжнародній нараді в 1960 році в м Денвері, в подальшому дещо змінені і доповнені (1963 р, Лондон і 1966 р, Чикаго). Відповідно до класифікації всі хромосоми людини поділені на 7 груп, розташованих в порядку зменшення їх довжини, і позначаються буквами англійського алфавіту від А до G. Всі пари хромосом стали нумерувати арабськими цифрами.

Група А (1 -3-я) - найбільші хромосоми; 1 і 3-я -метацентріческіе, 2-я - субметацентріческіе.

Група В (4 і 5-я) - великі субметацентріческіе хромосоми.

Група С (6 12-я і Х-хромосома) - субметацентріческіе хромосоми середнього розміру.

Група D (13- 15-я) - акроцентріческіе хромосоми середніх розмірів.

Група Е (16-18-я) - маленькі субметацентріческіе хромосоми.

Група F (19 і 20-я) - найменші метацентріческая хромосоми.

Група G (21, 22-я і У) - найменші акроцентріческіе хромосоми.

Запропонована класифікація дозволяла чітко розрізняти хромосоми, що належать до різних груп (малюнки).

З 1960 року починається бурхливий розвиток клінічної цитогенетики: в 1959 р Дж. Лежен відкрив хромосомну природу синдрому Дауна; К. Форд, П. Джекоб і Дж. Стронг описали особливості каріотипу при синдромах Клайнфельтера і Тернера; на початку 70-х рр. була відкрита хромосомна природа синдромів Едвардса, Патау, синдрому «котячого крику»; описана хромосомная нестабільність при ряді спадкових синдромів і злоякісних захворюваннях.

Малюнок - Хромосомний набір чоловіка

Малюнок - Хромосомний набір жінки

Разом з тим застосування методу отримання рівномірно забарвлених хромосом виявилося недостатньо ефективним для ідентифікації хромосом.

На початку 70-х рр. були розроблені методи диференціальної забарвлення хромосом, які дозволяли однозначно ідентифікувати кожну хромосому. Методи були засновані на здатності деяких барвників специфічно зв'язуватися з конкретними ділянками хромосом в залежності від їх структурно-функціональної організації. Запропоновані методи виявляли лінійну неоднорідність (сегменти) хромосом. На практиці найбільше застосування отримали методи диференціальної забарвлення барвником Гімза (G-забарвлення) і флюоресцирующим барвником акрихином або акріхініпрітом (Q-забарвлення).

На малюнку представлені хромосоми людини при G-забарвленні. Добре видно, що кожна хромосома людини має тільки їй властиву послідовність разношірокіх смуг.

Це дозволяє точно ідентифікувати будь-яку з хромосом і виявляти відносно великі зміни в їх структурі. При аналізі метафазних хромосом середньої конденсації можна чітко розрізнити близько 350-400 щодо великих сегментів на гаплоїдний набір. На стадіях, що передують метафазі, хромосоми менше спіралізують і тому мають велику поперечну підрозділів. Були розроблені методи аналізу хромосом на клітинах, що діляться в стадії прометафазі. Використання цього методичного підходу дозволило отримати хромосоми з різним ступенем сегментації - від 800 до 2500 сегментів на гаплоїдний набір.

Поперечнасмугастість, що виявляється різними методами, в принципі виявляє одні і ті ж сегменти хромосоми і є результатом нерівномірного конденсації хроматину по всій її довжині. Залежно від ступеня спирализации ДНК в хромосомі виділяють гетерохроматіновие і еухроматіновие райони, для яких характерні різні функціональні і генетичні властивості.

Гетерохроматинових район являє собою ділянку конденсованого хроматину (високоспіралізованная ДНК), який виявляється при диференціальному фарбуванні у вигляді темних смуг. Присутність гетерохроматина можна виявити і в інтерфазних ядрі, де він чітко виявляється у вигляді інтенсивно забарвлених грудочок хроматину. Зчитування генетичної інформації з даних ділянок не відбувається. Розрізняють структурний і факультативний гетерохроматин. Структурний гетерохроматин постійно присутня в певних регіонах хромосоми. Наприклад, він завжди виявляється навколо центромер всіх хромосом. Факультативний гетерохроматин з'являється в хромосомі при сверхспіралізаціі еухроматінових районів. Факультативної гетерохроматізаціей може бути охоплена ціла хромосома. Так, в клітинах жіночого організму одна з Х-хромосом повністю інактивована шляхом гетерохроматізаціі вже на ранніх етапах ембріонального розвитку. Її можна виявити у вигляді грудочки гетерохроматину на периферії ядра. Така інактивована Х-хромосома називається статевим хроматином, або тільцем Барра (малюнок). Завдяки гетерохроматізаціі Х-хромосоми в клітинах жіночого організму відбувається вирівнювання кількості генів, що функціонують в чоловічому і жіночому організмах, оскільки у чоловіків є тільки одна Х-хромосома.

Еухроматіновие регіони хромосом в інтерфазних ядрі не помітні, оскільки представлені хроматином в деконденсірованном стані. Це вказує на їх високу метаболічну активність. Дійсно, еухроматіновие райони містять унікальні гени, які контролюють синтез різних білків. При диференціальному фарбуванні метафазних хромосом вони визначаються як світлі смуги.




Генетична структура популяції самоопилітелей | Генетична структура популяцій перекрестноразмножающіхся організмів | Основні фактори генетичної динаміки популяцій | Людина як об'єкт генетичних досліджень | генеалогічний метод | ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ родовід | Близнюковий метод | Популяційно-статистичний метод | цитогенетичний метод | Метод генетики соматичних клітин |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати