загрузка...
загрузка...
На головну

Методи генної інженерії

  1. III. ФІЗИЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
  2. III. Етапи, регламент i методика правядзення дзелавой гульнi
  3. Part II. Methods and Means / методи і засоби
  4. VII. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-психологічні методи дослідження МИСЛЕННЯ І МОВИ
  5. А. Методи регулювання свого емоційного состоянія7
  6. Абсолютний вік гірських порід і методи його визначення
  7. автоматизовані методи

Поняття про генну інженерію. Рекомбінантні ДНК, принципи їх конструювання. Клонування фрагментів нуклеїнових кислот in vivo. Визначення по няття вектора в біології. Вектори: плазміди, бактеріофаги, косміди, штучні хромосоми. Методи пошуку специфічних рекомбінантних ДНК. Геномні ДНК-бібліотеки, бібліотеки кДНК.

Трансгенні організми. Принцип конструювання трансгенних організмів. Трансгенні бактерії. Головні напрямки застосування в народному господарстві та медицині. Рекомбінантні лікарські препарати. Трансгенні рослини. Головні напрямки використання трансгенних рослин. Трансгенні тварини як моделі захворювань і біореактори. Проблеми екологічної безпеки.

Генна терапія. Принципи генної терапії. Генотерапія ex vivo і in vivo. Вірусні та невірусні вектори в генотерапіі. Перспективи та обмеження генної терапії. Генні вакцини. Генна терапія в онкології.

Генна інженерія. Технологія рекомбінантних ДНК. Генна інженерія виникла в 1972 році, в Стенфордському університеті, в США. Тоді лабораторія П. Берга отримала першу рекомбінатних (гібридну) ДНК або рекДНК. Вона поєднувала в собі фрагменти ДНК фага лямбда, кишкової палички та мавпячого вірусу SV40.

На початку 1970-х молекулярні біологи розробили принципово нові технології, засновані на відкриттях в області біохімії і молекулярної генетики. Це надало величезні можливості маніпулювання генетичним матеріалом. Нові підходи та методи отримали назву «технології рекомбінантних ДНК», часто звані «генною інженерією». Ці технології революціонізували біологію і справили величезний вплив на медицину. З їх допомогою можна проводити обмін генетичною інформацією між хромосомами, створюючи нові геноми. Наприклад, можна отримувати трансгенні організми, бактерії, які експресують гени людини, проводити генну терапію людини та ін. Таким чином, генна інженерія - це розділ молекулярної генетики, що використовує різні методи маніпуляцій з нуклеїновими кислотами (технології рекомбінантних ДНК) для цілеспрямованого зміни генетичних програм і створення нових генотипів. Генна інженерія складається з наступних основних етапів: а) отримання генетичного матеріалу, що містить потрібні гени; б) включення цих генів в автономну генетичну систему (вектор), здатну до реплікації і встраиванию в чужій геном; в) введення цієї системи в реципієнтную клітку, де нові гени входять до складу ДНК. На зазначених етапах використовується багато молекулярно-генетичних підходів і методів. Розглянемо деякі з них.

Генетичний матеріал можна отримувати двома способами: шляхом хімічного синтезу і шляхом ферментативної рестрикції ДНК.

Хімічний синтез ДНК здійснюється з нуклеотидів в спеціальних умовах (мал.55 А) на основі повністю розшифрованої нуклеотидной

Мал.55. Схеми шляхів синтезу генетичного матеріалу

А - синтез з нуклеотидів; Б - синтез на основі зворотної транскрипції мРНК: 1 - отримання мРНК з клітин; 2 - зворотна транскрипція; 3 - утворення дволанцюгової кДНК

послідовності певної ділянки ДНК. Штучний ген аланиновой тРНК був вперше синтезований Г. Кораною в 1970 р Цей ген складався з 77 пар нуклеотидів, але не мав регуляторних відділів і тому не функціонував. Через кілька років Корану синтезував ген тирозинового тРНК, що містить промотор та термінатор. Цей ген, введений бактеріям, функціонував як натуральний. В даний час синтезовано вже багато різноманітних генів.

Синтез деяких генів можна проводити також за допомогою мРНК і ферментів зворотної транскрипції (мал.55 Б). У певних умовах на матриці мРНК за допомогою спеціальних ферментів Ревертаза синтезується комплементарна ланцюг ДНК. Потім на ній як на матриці утворюється другий ланцюг ДНК. Така штучно отримана молекула називається ДНК-копією або кДНК.

Рестрикція ДНК це процес «розрізання» молекул ДНК прокаріотів і еукаріот спеціальними ферментами, що дозволяє отримувати ділянки, що містять певні гени.

Одним з найважливіших інструментів генної інженерії є ендонуклеази - ферменти, що розщеплюють ДНК за специфічними послідовностям нуклеотидів всередині ланцюга. Ці ферменти отримали назву рестриктаз. Рестріктази розщеплюють ДНК на відносно невеликі фрагменти в ділянках строго визначених послідовностей (ріс.56). Цим їх вплив відрізняється від більшості інших ферментативних, хімічних або фізичних впливів, що призводять до випадкових розривів ланцюгів ДНК. Рестріктази (вже відкрито понад 200 типів ферментів цього класу) є

Ріс.56. Схема рестрикції ДНК (А) і освіту рекомбінантних (химерною) ДНК (Б): 1. Рестріктази розпізнають певні нуклеотидні послідовності ДНК і «розрізають» її в місцях, позначених стрілками. 2. Фрагмент вихідної ДНК з «липкими кінцями», готовими до комплементарному взаємодії. 3. Фрагмент «чужий» ДНК, отриманий також після рестрикції тим же видом рестриктаз. 4. Рекомбінантна (химерна) ДНК, що складається з «своїх» і «чужих» генів

частиною захисної системи бактерій, які охороняють власний геном від чужорідної, головним чином вірусної ДНК. Рестріктази прийнято називати за назвою бактерій, з яких їх виділяють. Так, назва EcoRI свідчить про те, що цей фермент з Esherichia coli. ВатН1 - з Bacillus amilolquefacientsi. Кожен фермент дізнається певну 4-7-членну послідовність в двухцепочечной ДНК. Розрізання ДНК по цих сайтів призводить до утворення або «тупих» (наприклад, при дії рестриктаз Hpal), або «липких», тобто перекриваються (наприклад, ВатН1),-решт. Для конструювання гібридних молекул особливо зручні липкі кінці (ріс.56). Будь-фрагмент ДНК має характерний розташуванням сайтів впізнавання різних рестриктаз, що дозволяє будувати так звані рестріктазного карти. При розщепленні ДНК будь-якої однієї рестриктазой отримують суміш фрагментів, кожен з яких має одні й ті ж кінцеві ділянки. Такі фрагменти можна розділити і ідентифікувати методом електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі.

Біологічні вектори: (Плазміди, бактеріофаги, косміди, штучні хромосоми).

Вектор - це щось на зразок молекулярного «таксі», здатного переносити чужу ДНК всередину клітини-господаря таким чином, щоб вона там могла реплицироваться.

Вектор, що включає в себе фрагменти чужорідної ДНК, повинен проникати в реціпіентние клітини, вибрані для клонування гена. Ці клітини можуть бути як про-, так і еукаріотичних. Найчастіше для цієї мети використовують бактерії, оскільки їх легко отримувати у великій кількості. Вбудовані в плазміди чужі гени передаються в клітку господаря шляхом трансдукції і вбудовуються в їх геном, де здатні до швидкої реплікації за допомогою ферментів клітини-господаря. Процес швидкого отримання великої кількості однакових копій молекул називається клонуванням. Клон - це велика популяція ідентичних молекул, клітин, організмів, отриманих від одного предка. Шляхом клонування вектора в реципієнтних клітинах можна забезпечити отримання великої кількості потрібного гена в високоочищеним вигляді або великої кількості білка, кодованого даним геном. У геном тварин фрагменти чужої ДНК вводять шляхом мікроін'єкції безпосередньо в ядро ??клітини.

Існує два основних типи векторів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги.

бактеріальні плазміди - Це невеликі кільцеві молекули двухцепочечной ДНК, до функцій яких входить, наприклад, забезпечення стійкості до антибіотиків. Плазміди володіють декількома властивостями, які роблять їх надзвичайно зручними для використання в якості векторів. Зокрема в бактеріальної клітці вони можуть існувати в безлічі копій, можуть реплицироваться незалежно від хазяйської ДНК. Для багатьох плазмид відома повна нуклеотидная послідовність. Це робить можливим точну локалізацію сайтів рестрикції для клонування фрагментів ДНК. Плазміди значно менше хазяйської хромосомної ДНК і тому можуть бути легко відділені від неї. Клонований фрагмент легко виділяється з рекомбінантної плазміди за допомогою її розщеплення тієї ж рестриктазой.

бактеріофаги зазвичай містять лінійну ДНК, в яку можуть бути вбудовані фрагменти чужорідної ДНК з будь-якого з доступних сайтів рестрикції. Основною перевагою фагів векторів перед плазмідними є те, що в них вдається вбудовувати в 2-3 рази більші фрагменти «чужий» ДНК.

Ріс.57. Схема основних етапів і методів генної інженерії:

1 - отримання ДНК з ядер; 2 - рестрикция ДНК на фрагменти (фрагмент 6 містить цікавий для нас ген); 3 - поділ фрагментів за допомогою електрофорезу; 4 - ідентифікація цікавить нас фрагмента методом гібридизації зі спеціальним ДНК-зондом; 5 - виділення потрібного фрагмента; 6 - синтез потрібного фрагмента; 7 - клонування фрагментів методом ПЛР; 8 - включення фрагмента ДНК в плазміду (вектор); 9 - введення плазміди в бактерію; 10 - введення фрагмента ДНК безпосередньо в ядро ??клітини реципієнта; 11 - рестрикция плазміди; 12 - включення в плазміду фрагмента ДНК

Необхідні гени вирізаються з хромосом тварин, инкубируются з плазмідами або фагами, які також розрізані спеціальними рестріктазамі (ріс.56 і 57). Через деякий час фрагменти різних ДНК з'єднуються відповідно до принципу комплементарності і ДНК плазміди відновлює вихідну кільцеву форму. Так можна з'єднувати відрізки ДНК, отримані з різних клітин і створювати комбінації різноманітних генів в одній молекулі. Для з'єднання ділянок ДНК застосовують лігази - один з ферментів репарації. Процес ковалентного з'єднання «липких» кінців фрагментів ДНК називають «лігуванням». Використовуючи різні рестріктази і лігази, можна розрізати і зшивати нитка ДНК в різних місцях і отримувати різноманітні рекомбінантні (химерні) молекули.

Косміди. Вектори, звані космідамі, можуть включати до 40 тисяч пар нуклеотидів чужорідної ДНК і при цьому активно ампліфікувати в Е. coli як плазміди. Косміди об'єднують в собі властивості плазмідних векторів і векторів на основі фага ?. Наприклад, широко застосовувана косміда pLFR-5 (приблизно 6 тисяч пар нуклеотидів) має два cos-сайту фага ?, точку початку реплікації ДНК і ген стійкості до тетрацикліну. Ця косміда може інтегрувати чужорідну ДНК, довжина якої до 40 тисяч пар нуклеотидів.

Опинившись в бактеріальної клітці, лінійна молекула pLFR-5 зі вставкою замикається в кільце завдяки парування cos-сайтів. У такій стабільній конфігурації вона може довгий час існувати в клітці і репліціроватся як гібридна плазміда, оскільки містить всі необхідні для цього елементи. Більш того, ген стійкості до тетрацикліну забезпечує зростання колоній, які несуть цю косміду, на середовищі з цим антибіотиком; трансформовані клітини при цьому гинуть. Існують і інші космідние вектори на основі фага ?.

Косміди мають велику перевагу в порівнянні з плазмідами: в них можна вбудовувати довші фрагменти ДНК, а це означає, що для створення геномної бібліотеки потрібна менша кількість клонів і буде потрібно менше часу на їх скринінг.

Векторні системи, здатні інтегрувати великі вставки (> 100 тисяч пар нуклеотидів) мають велику цінність

при аналізі складних еукаріотичних генів. Без таких векторів не обійтися, наприклад, при картуванні генома людини. На відміну від бібліотек з невеликими вставками найчастіше буде представлений весь генетичний матеріал організму. Крім того, в цьому випадку зменшується число клонів, яке потрібно підтримувати, і збільшується ймовірність того, що кожен з генів буде присутній в «своєму» клон.

Штучні хромосоми. Для клонування фрагментів ДНК розміром від 100 до 3000 тисяч пар нуклеотидів був сконструйований нізкокопійний плазмідний вектор на основі бактеріофага Р1. Це химерна конструкція, звана штучної хромосомою. Був створений також дуже стабільний вектор, здатний інтегрувати вставки довжиною від 150 до 300 тисяч пар нуклеотидів, на основі F- плазміди E.coli, яка представлена ??в клітці однієї або двома копіями з селекційної системою lac Z - ця конструкція називається бактеріальної штучної хромосомою.

Штучні хромосоми містять три основних елементи: кінцеві ділянки (теломери), центромеру і точки ініціації реплікації. Властивості теломерна областей хромосом людини добре вивчені, чого не можна сказати про центромеру і точках ініціації реплікації. Існували побоювання, що штучні хромосоми не вдасться сконструювати, поки не будуть досконально вивчені всі її елементи. Однак вже отримані і підтримуються в трансфіцірованой культурі клітин стабільні, лінійні, штучні хромосоми людини (мікрохромосоми), що складаються з безлічі ДНК повторів (довжиною близько 1 мільйона пар нуклеотидів), центромерная області, високомолекулярних фрагментів геномної ДНК і теломерна ділянок. В їх центромерная область був вбудований ген стійкості до неоміцину, що дозволило використовувати середу З 418 в якості селективної.

Дві з трьох мікрохромосом були отримані «урізанням» існуючої хромосоми. В одному випадку вихідна центромера була збережена, а в іншому замінена трансфіцірованой центромерная областю. Третю, повністю штучну мікрохромосому отримали лігуванням in vitro трьох трансфікованих ДНК-елементів. Ясно, що створення штучної хромосоми людини, що містить «терапевтичні» гени, цілком реально. Основною проблемою стане доставка цієї величезної молекули ДНК в ядро ??клітини-мішені. Крім, того, експресія генів, що входять до складу ДНК-блоків, з яких побудована штучна хромосома, може мати шкідливий вплив на клітини-мішені. Для початку в тканини пацієнта можна спробувати імплантувати інкапсульовані клітини з штучними хромосомами. Зовсім недавно вченими були створені лентівірусние вектори. Вони широко використовуються при генетичних захворюваннях, так як їх структура допускає перенесення великих генів, наприклад генів гемоглобинов, факторів згортання VIII, IX та інших. Головна перевага лентівірусних векторів перед іншими ретровирусами - в можливості інтеграції в геном всіх клітин. Це особливо важливо для перенесення генів в примітивні стовбурові кровотворні клітини, так як основна маса останніх знаходиться поза клітинного циклу, а мобілізація в цикл істотно позначається на пролиферативном потенціал і долі стовбурових кровотворних клітин при трансплантації.

Геномні бібліотеки і кДНК бібліотеки. Підібравши відповідні умови рестрикції і клонування можна домогтися того, що в наборі клонованих фрагментів будуть міститися практично всі гени даного геному. Такі колекції клонів, отримані від конкретного генома, називають геномними «бібліотеками». Геномна бібліотека готується з тотальної ДНК клітинної лінії або тканини.

На відміну від геномної бібліотеки, бібліотека кДНК готується з мРНК тканини. Бібліотека кДНК також складається з усіх генів даного геному готується в кілька етапів. Спочатку виділяють тотальну мРНК тканини. Потім за допомогою зворотної транскриптази і ДНК-полімерази проводять зворотну транскрипцію мРНК в двухцепочечную ДНК (кДНК). Зазначені «бібліотеки» використовуються для вивчення нуклеотидноїпослідовності, локалізації генів, їх структури і патології.

Трансгенні організми. Принцип конструювання. Трансгенезу - штучний перенесення гена або групи генів з одного організму в інший і створення умов для його / їх експресії (тобто вираження: транскрипції, трансляції, що призводять до появи в клітинах організму-реципієнта
 біологічно активного генного продукту). Основою для розвитку дослідницьких робіт по міжвидового транспорту генів послужили серйозні досягнення останніх десяти років в області генної інженерії - т. Е. Технології маніпулювання з рекомбінантної ДНК.

Його мета - отримання організмів з новими ознаками, зміна спадковості складних багатоклітинних організмів. Такі організми називають трансгенними. Для трансгенеза використовують кілька методичних прийомів - інтродукція генів в ізольовані клітини реципієнта з наступною ретрансплантаціі цих клітин, ін'єкція гена безпосередньо в організм реципієнта, інтродукція клонованих генів в геном ембріона на ранніх стадіях розвитку. Найчастіше використовують останній метод. При цьому з материнського організму (наприклад, миші) беруть тільки що запліднену яйцеклітину. У зону чоловічого пронуклеуса шляхом ін'єкції вводять клоновані гени, потім самкам пересаджують ембріони, які розвивалися в культуральних середовищах. При цьому досягається досить високий рівень імплантації і народження повноцінних мишей. В процесі трансгенеза відбувається вбудовування нового гена в геном зародка. Внаслідок цього отримують тварин з новим геном і вони забезпечують передачу його наступному поколінню шляхом статевого розмноження. Слід також враховувати, що введений ген зазвичай вбудовується в одну з гомологічних хромосом, тому трансгенними будуть не всі нащадки. Здійснено успішне перенесення в геном миші гена гормону росту людини. Маса трансгенних мишей і їх нащадків була в 1,5-2 рази більше. Нині широко ведуться дослідження по отриманню трансгенних кроликів, овець, птиці, свиней. Швидкими темпами розробляються методи створення трансгенних тварин, які можуть синтезувати деякі препарати (інсулін, інтерферон, фактори згортання крові, гормони, незамінні амінокислоти).

У перспективі є можливість отримувати так званих трансгенних тварин, в зиготу яких буде внесено кілька генів (політрансгенние тварини). Але при цьому виникає небезпека руйнування еволюційно збалансованого генома тварин.

Введення генів в клітини і їх експресія. Після розчинення захисної оболонки протеолітичнимиферментами з яйцеклітиною можна проводити різні маніпуляції і вводити в неї микроколичества нуклеїнової кислоти. Яйцеклітину діаметром близько 0,1 мм поміщають на кінець микропипетки, і експериментатор за допомогою мікроскопа і скляного капіляра з зовнішнім діаметром не більше декількох десятків мікрон вводить в яйце кілька піколітрів (10-12 пл.) Чужих фрагментів ДНК. Ін'єкція - найбільш відповідальний етап експерименту, оскільки в цей момент можна нанести значні пошкодження яйцю або ембріону. Найкраща інтеграція і експресія генів досягається при ін'єкції в чоловічій пронуклеус, що дозволяє звести до мінімуму пошкодження ооцита, оскільки пронуклеус розташовується поблизу його мембрани. Таким чином, вдається домогтися включення одного або декількох генів в геном ембріонів ссавців. Ці гени можуть експресуватися і передаватися нащадкам. Слід підкреслити деякі складності і неясності, з якими пов'язана ця процедура. Процес інтеграції генів в геном клітин ссавців є маловивченим. Як показали дослідження, ця інтеграція відбувається випадковим чином і не пов'язана з конкретною ділянкою хромосоми. Інша складність обумовлена ??нестабільністю клітин, в які вводиться ген (або гени), де він може бути втраченим, видозміненим або неактивним. Активність генів визначається не тільки послідовностями нуклеотидів, які забезпечують транскрипцію генів з утворенням мРНК, але також іншими послідовностями нуклеотидів, які стоять віддалено від власне гена. Для досягнення повної експресії гена ці послідовності необхідно вводити разом з ним.

Трансгенні бактерії.У різних сферах господарської діяльності людини використовуються трансгенні бактерії. Крім того, що бактерії використовуються для клонування генів і виробництва білка, вони реконструюються і для інших цілей.

Так, біоінженерні бактерії використовуються для оздоровлення рослин. Бактерії, що живуть в рослинах і стимулюють утворення шматочків льоду, були змінені з холод-плюс на холод-мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рослин від морозу. У бактерій, що утворюють симбіоз з корінням кукурудзи, були введені гени (від інших бактерій), що кодують токсин для шкідливих комах.

У природі існують бактерії, що можуть розщеплювати будь-яку органічну речовину. Бактерії відбираються за здатність розщеплювати певну речовину, а потім ця здатність посилюється під час біотехнології. Таким шляхом були утворені бактерії, які поїдають нафту, що розлилася під час техногенних катастроф.

Бактерії використовують для бактеріального синтезу. Так, були реконструйовані бактерії для виробництва амінокислоти фенілаланіну.

Широке використання рекомбінантних бактерій в сільському господарстві, промисловості, захисту навколишнього середовища обмежувалося тим, що такі бактерії можуть замінити природні мікроорганізми в екосистемах з виникненням несприятливих наслідків. На сьогоднішній день розроблені методи визначення, вимірювання та навіть блокування діяльності цих клітин в навколишнє середовище.

Рекомбінантні лікарські препарати. Серед багатьох досягнень генної інженерії, які отримали застосування в медицині, найбільш значне отримання людського інсуліну в промислових масштабах. Генні інженери в якості першої практичної задачі вирішили клонувати ген інсуліну. Клоновані гени людського інсуліну були введені з плазмидой в бактеріальну клітину, де почався синтез гормону, який природні мікробні штами ніколи не синтезували. Починаючи з 1982 року в США, Японії, Великобританії та інших країнах виробляють генно-інженерний інсулін. З 1000 літрів бактеріальної культури отримують приблизно 200 г інсуліну, що дорівнює кількості, що отримується з 1600 кг підшлункової залози тварин. Паралельно була вирішена проблема імунологічного ураження організму діабетиків тваринним інсуліном.

Понад двадцять фірм Японії і кілька американських фірм розробляли інший дуже важливий медичний препарат-інтерферон, який ефективний при різних вірусних захворюваннях і злоякісних новоутвореннях. Першим з цих сполук на ринок надійшов альфа-інтерферон, потім бета-інтерферон.

Ще один ефективний протираковий препарат - інтерлейкін проводиться в Японії і США. Цікаво відзначити, що сьогодні американський ринок медичних препаратів, отриманих методами генної інженерії, порівняємо з такими масовими ліками, як антибіотики.

Трансгенні рослини. На початковому етапі розвитку дослідницьких робіт по трансгенезу у еукаріотичних організмів однією з основних проблем був пошук і конструювання векторів-носіїв для перекидання «корисних» генів. Зараз ця проблема в значній мірі вирішена, що дало серйозний імпульс поширенню трансгенних маніпуляцій з рослинами і тваринами. Відносно рослин найбільш використовуваними векторами - носіями є Ti (tumor inducing) і Ri (root-inducing) плазміди, виділені з бактерій, здатних утворювати з вищими рослинами складні симбіотичні асоціації. Ti плазміди містять в складі своєї ДНК так звані Т-ділянки (від англійського transfer - перенесення), здатні вбудовуватися в ядерний геном деяких рослин. Вбудовування в Т-ділянку потрібного гена перетворює Ti-плазміди в вектор - носій для трансгенних маніпуляцій. Необхідно також відзначити, що генна інженерія і трансгенезу у рослин можуть зачіпати не тільки ядерний спадковий матеріал, але і ДНК хлоропластів і мітохондрій. Так, в мітохондріях кукурудзи були виявлені плазміди S-1 і S-2, що відкриває певні можливості для введення туди чужорідних генів.

В результаті детального вивчення молекулярно-генетичних основ пухлинного росту у рослин за участю бактерій роду Agrobacterium виявилося, що пухлинотворні плазміди агробактерій (Ti - tumor inducing, індукують пухлина), що представляють собою міні-кільцеві ДНК, є природною векторної системою, яку зараз використовують для переносу генів в рослини. Плазміда агробактерії, яка становить 12-22 тис. Пар основ, переносить частину своєї ДНК в ДНК рослинної клітини, в яку вбудовується «потрібний» ген. Вона кодує ферменти синтезу фітогормонів і опинилась - похідних амінокислот, які використовуються бактерією як джерело вуглецю, азоту та енергії.

За допомогою цього унікального вектора вже отримано велику кількість трансгенних рослин. Важливо також те, що методи генної інженерії зараз використовують не тільки в практиці, це найважливіша методологія для пізнання фундаментальних основ організації і функціонування рослинного геному.

Перенесення Т-ДНК з бактерії в цитоплазму рослинної клітини здійснюється за 30 хв.

Впровадження Т-ДНК в рослинний геном є багатоступеневим процесом. У геном рослини можуть вбудовуватися кілька копій Т-ДНК. Після вбудовування в хромосому Т-ДНК стає звичайною частиною генома рослини. Т-ДНК транскрибується в рослинних клітинах РНК-полімераза II рослини-господаря. Транскрипти мають особливості еукаріотичних матриць. Сама бактерія в клітку не проникає, а залишається в міжклітинному просторі і використовує рослинні клітини з вбудованою Т-ДНК як фабрику, продукує опінію-джерело азоту та вуглецю.

Т-ДНК Ti-плазмід володіє двома властивостями, що роблять її по суті ідеальним вектором для введення чужорідних генів у клітини рослин.

По-перше, коло господарів агробактерій дуже широкий: вони трансформують клітини практично всіх дводольних рослин. Відомо, що можна домогтися зараження однодольних, в тому числі злаків.

По-друге, інтегрована до складу геному рослини Т-ДНК успадковується як простий домінантний ознака відповідно до законів Менделя, а її гени мають власні промотори (регуляторна область гена, що визначає час і місце його експресії), під контролем яких можуть експресувати вставлені в Т -ДНК чужорідні гени.

Найпростіший спосіб введення Т-ДНК в клітини рослини полягає в тому, щоб заразити його A. tumefaciens, що містить відповідну Ti-плазміди, і надати подальше природному ходу подій. В цілому ідеальна векторна система на основі Ti-плазміди повинна:

· Містити всі сигнали, необхідні для перенесення і стабільної
 інтеграції в ядерну ДНК рослин; систему для експресії чужорідних генів в рослинах (впізнаваний рослинними полимеразами промотор), маркер, який необхідний для селекції трансформованих клітин;

· Не містити онкогенів, тобто генів, які пригнічують диференціювання рослинних клітин. Другий пункт досягається за допомогою транспозони мутагенезу.

В результаті введення транспозона в Т-ДНК можна виключити гени, які призводять до пухлиноутворення, що не відбивається на механізмі перенесення Т-ДНК. Зазвичай використовують бактеріальні транспозони (Тп 5, Тп 7).

Крім того, при конструюванні векторних молекул має бути передбачено наявність промоторів, що працюють в рослинах. Промотор (ділянка, до якого приєднуються РНК-полімерази) повинен володіти набором властивостей, а саме: силою (активної експресією), можливістю регуляції, тканини-і органспеціфіческой експресією. Так, наприклад, до регульованим промотор відноситься промотор генів білків теплового шоку (генів, активність яких активується при підвищеній температурі), а тканеспеціфічная експресія характерна для генів, що контролюють синтез запасних білків, наприклад зеина, який виявлений тільки в тканинах насіння злаків. Найбільш популярним є промотор гена вірусу мозаїки цвітної капусти 12 (CAMV). Гени, підшиті до такого промотор, активно експресуються в усіх тканинах.

Нарешті, в векторі повинні бути передбачені маркери, за допомогою яких можливий відбір трансгенних рослин. У літературі маркерні гени ще називають репортерного. Їх досить багато. Наприклад, luxA і luxB це гени, виділені з ДНК світлячків. Вони контролюють синтез люціферази, яка забезпечує перехід люцефірінов з окисленої форми в основну, що і забезпечує світіння. Останнім часом користується популярністю інший ген-репортер - pgfp, який контролює синтез GFP-білка (green fluorescent protein). Цей ген був виділений з ДНК медузи Acquorea victoria. Трансгенні рослини з цим геном світяться в ультрафіолеті зеленим світлом.

Традиційний спосіб трансформації рослинних клітин за допомогою Т- ДНК полягає в нанесенні агробактерій, що містять Ti-плазміди, на спеціально пошкоджений втечу. Зараз використовують широкий арсенал методів для отримання трансгенних рослин. Створено навіть спеціальний прилад - «Shotgun», який стріляє дрібними вольфрамовими кульками, одягненими в молекули ДНК, здійснюючи, таким чином, трансформацію рослинних клітин.

 
 

Ріс.58. Генетична колонізація вищої рослини бактерією A. tumefaciens: 1 - A. tumefaciens існує в ризосфері (кореневої сфері) рослини; 2 - в клітинах бактерії поряд з її хромосомою існує Тi-плазміда; 3 - Ti-плазміда проникає в клітину рослини, і частина її (T-ДНК) вбудовується в геном рослини; 4 - це призводить до утворення пухлини - корончатого галла і синтезу опинилась

Експериментатори розглядають грунтову бактерію як природного геноінженера. Довелося тільки обеззброїти її: опухолеіндуцірующую область плазміди видалили і замінили на штучно сконструйований вектор, до якого включено обраний чужий ген, стерпний в ядерний геном рослин. Слід зазначити, що всі трансгенні рослини отримані на основі схеми агробактеріальної перенесення (ріс.58). Однак вона ефективна лише для дводольних рослин. Для однодольних, в основному злакових рослин, розроблені інші способи перенесення генетичних конструкцій, з них частіше використовується балістичний - за допомогою установки під назвами «генна гармата», або «дробовик». На мікрочастинки золота або вольфраму поміщаються ДНК-вектори і під тиском «вистрілюють» в рослинні клітини.

Зараз розробляється отримання так званих їстівних вакцин. Цим займаються багато лабораторій у світі, але поки на експериментальному рівні. На перших етапах роботи отримані трансгенні рослини тютюну і люцерни з геном Р-інтерферону людини, дуже потужного імуногенною фактора. Потім приступили до створення трансгенних рослин тютюну та люцерни з генами імуногенних білків мікобактерій, що викликають туберкульоз, і з генами оболонки вірусу гепатиту В. При експресії подібних генів в рослинах, які з'їдають тварини, в їх організмі передбачається отримати імунну відповідь з утворенням антитіл на продукується антиген . Іншими словами, буде проведена природна вакцинація по стійкості до захворювання на туберкульоз або гепатитом В. У цьому і полягає сенс створення їстівних вакцин.

В даний час у 120 видів рослин існують трансгенні форми. Дозволено використання трансгенних сої, кукурудзи, бавовни, рапсу, картоплі, томатів, буряка, гарбуза, тютюну, тато, льону; закінчуються випробування трансгенної рису і пшениці. Трансгенні рослини вирощуються в 11 країнах світу - США, Китаї, Аргентині, Канаді, Австралії, Мексиці, Іспанії, Франції, Південній Африці, Португалії та Румунії. У 2000 р під ними була зайнята площа близько 40 млн. Га.

З використанням трансгенних рослин були вирішені такі проблеми, як гербіцідоустойчівость, стійкість до комах, до вірусів, до грибкових та бактеріальних захворювань, регулювання строків дозрівання, підвищення загальної продуктивності, їстівні вакцини. Сьогодні вирощується 71% трансгенних рослин, стійких до гербіцидів, 22% - до шкідників і 7% - до гербіцидів і шкідників (в основному соя, кукурудза, бавовна, ріпак). Йде пошук підходів до різкого підвищення продуктивності рослин.

Ведуться роботи по утворенню біоінженерних рослин, які могли б мати такі особливості: 1) високу пристосовну до умов зовнішнього середовища; 2) вміщати більшу кількість необхідних для людини поживних речовин; 3) довгий час збережуться.

Розробляються трансгенні рослини, які здатні продукувати в інтересах людини хімічні речовини і ліки. Реконструйовано картоплю для продукції альбуміну людини. Передбачається, що в майбутньому рослини зможуть утворювати в своїх насінні такі білки, як гормони людини.

Трансгенні тварини як моделі захворювань і біореактори.Трансгенних тварин, чиї клітини виробляють потрібні білки, можна називати біореактора. Від них можна отримувати потомство, тобто процес відтворюється з покоління в покоління.

Створення трансгенних тварин починається зі «зшивання» двох генів, кожен з яких клонований окремо. Один ген кодує потрібний білок, інший узятий із залози або іншого органу, який буде виробляти цей білок. Наприклад, якщо білок продукується з молоком, то специфічними органними генами будуть гени з молочної залози.

Гібридна ДНК ін'еціруется в запліднену яйцеклітину або в ембріон. Приблизно в 5-10% випадків ДНК вбудовується в геном. Всі яйцеклітини підсаджують в самок, а народжених тварин перевіряють на присутність гібридного гена. Від «тварини-засновника» отримують потомство і створюють стадо.

Одним із прикладів живих біореакторів є свиня, яка продукує нь (гемоглобін) людини. «Сконструйована» вона в 1991 р Близько 15% еритроцитів свині містять людський гемоглобін. Його можна відокремлювати від свинячого за допомогою препаративних методів. Такий нь не містить вірусів людини. Однак в окремих випадках не можна виключити алергічні реакції.

Іншим трансгенним тваринам з'явилася корова, яка з молоком виробляє людський лактоферин. В результаті підсадки трансгенної яйцеклітини народився бик, від якого отримано багато трансгенних телиць, в подальшому виробляють і виділяють лактоферрин з молоком.

Отримано та інші трансгенні тварини. Коза виділяє з молоком активатор плазміногену, який розчиняє тромби; трансгенні кролики - фермент осглюкозідазу для лікування хвороби Помпі; трансгенні кури несуть яйця з людськими антитілами.

У 70-х роках була показана можливість отримання ферментів з тканин людини та розроблені системи спостереження за долею ферментів в організмі ссавців. Перші клінічні випробування були проведені при різних лізосомних порушеннях: Гангліозідози Ош типу 2 (Р-гексозамінідази А з сечі), глікогенозі типу 2 (плацентарна а-галактозидаза), хвороби Фабрі (плацентарна а-галактозидаза), хвороби Гоше (плацентарна р-глюкозидаза) . Перед клінічним випробуванням було встановлено, що високоочищені ферменти людини гидролизуют природний субстрат. Перевірка показала, що ферменти виявляються в печінкової тканини при їх внутрішньовенному або підшкірному введенні. При цьому концентрація ферментів в крові зменшується, а в печінці підвищується. Однак вони не проникають в мозок в результаті бар'єрних функцій мозкових оболонок. Звідси випливає висновок про специфічну доставку ферментів в клітини-мішені при кожній хвороби. Доставка їх у різні клітинні структури може зажадати специфічної очищення або будь-якої хімічної модифікації ферменту.

Експериментальні розробки в області ферментотерапии спадкових хвороб дозволили об'єктивно оцінювати захоплення молекул ферменту рецепторами, гепатоцитами, клітинами ретикулоендотеліальної системи, фібробластами, клітинами ендотелію судин і т.д. Це збільшило можливості спрямованих розробок лікування спадкових хвороб і в першу чергу розробок з використанням нових методів доставки ферментів до клітин-мішеней в синтетичних «бульбашках-носіях» або мікрокапсулах- ліпосоми, або природних елементах - аутологічних еритроцитах. Такі методи доставки розробляються для лікування не тільки спадкових хвороб, а й інших видів патології. Спрямована доставка лікарських речовин до органів, тканин і клітин є актуальною проблемою для медицини в цілому.

Цінним інструментом для генетичних досліджень стали трансгенні миші. Вони дають інформацію при плануванні генної терапії людини. Вчені, які вивчають м'язову дистрофію Дюшена, виділили ген, який відсутній у хворих. Запропоновано спосіб забезпечення хворих дітей дистрофина. Але що буде, якщо дистрофії потрапить в інші тканини, або його буде утворюватися дуже багато? Для вирішення цих питань були створені трансгенні миші, в м'язах яких є дистрофина в 50 разів більше, а також відбувається продукція цього білка в інших тканинах. Дистрофії не викликає у таких мишей патологічних відхилень.

Трансгенні миші виявилися необхідними при вивченні злоякісних пухлин, моногенних і мультифакторіальних хвороб людини. Але трансгенна технологія є неточною, тому що введення ДНК не спрямоване на певний локус хромосоми. Ген, що переноситься, може порушити функцію іншого гена або потрапити під контроль інших генів. Навіть якщо трансгени вбудовується в хромосому і експресується, його ефект може бути перекритий таким же геном клітини-господаря. Тому була розроблена технологія більш точного «прицілювання» гена, при якому ген, що вводиться, займає місце свого двійника в хромосомі клітини господаря. При цьому використовується природний процес гомологической рекомбінації. Внаслідок такої технології замінюють инактивирование геном активний ген у мишей і стежать ефект його відсутності навіть в ембріоні. Так вивчають функцію білків імунної системи, механізм взаємодії онкогенів у виникненні пухлини, розвитку генетичних захворювань.

«Прицілювання» гена - складна методологія, вона не працює в заплідненої клітці ссавців. Ген можна ввести тільки в клітини на ранніх етапах розвитку зародка, до його імплантації в стінку матки.

Тварин з «виключеним» геном використовують у вивченні складних захворювань, у яких задіяно багато генів. Так, наприклад, вивчають атеросклероз шляхом інактивації з'єднання генів, продукти яких контролюють ліпідний метаболізм.

Проблеми екологічної безпеки. Вважається, що трансгенезу у рослин і тварин - найбільш перспективна біотехнологія для вирішення продовольчої і медичної проблем на найближче десятиліття. Трансгенні тварини - кози, вівці, свині, корови - використовуються для секреції під промоторами «генів молока» високоактивних біологічних речовин для медицини і фармакології. Вже пройшли ліцензування і надійшли на ринок отримані через трансгенних тварин антитрипсин, застосовуваний при легеневих захворюваннях, антитромбін III для запобігання інфарктів та інсультів, фактори згортання крові, білок С, що володіє захисними функціями, і ряд інших.

Однак у всьому світі в засобах масової інформації розгорнулася дискусія про небезпеки застосування генетично модифікованих організмів - трансгенних рослин і тварин. Наукової основи для такого занепокоєння немає, так як наш організм вже давно користується продуктами цих генів у вигляді пулу амінокислот і коротких невоспроізводящіхся фрагментів нуклеїнових кислот як основи для власних біосинтетичних процесів. Додамо, що кожне трансгенні рослини, рекомендований до застосування, проходить жорстку перевірку за багатьма параметрами з випробуванням на тварин і тільки після цього отримує ліцензію.

У Росії і Україні також йдуть бурхливі дискусії про небезпеки використання трансгенних організмів. Однак в нашій країні поки не обробляється жодне трансгенні рослини, хоча російськими вченими вже створені трансгенні рослини більш ніж у 20 видів, деякі з них зараз проходять ретельну перевірку.

Наведемо дві, до кінця ще не вирішені проблеми, пов'язані з використанням трансгенних рослин. Перша - витік трансгенів до інших диких видів-родичам через спонтанну гібридизацію. Хоча цей процес малоймовірний, він не виключається. Можна уявити наслідки, коли гени гербіцідоустойчівості раптом виявляться у бур'янів.

Так як трансгенні рослини стійкі до хвороб і шкідників, то не виключається підвищення стійкості самих збудників хвороб і тих же комах-шкідників, тобто їх коеволюція. Це друга проблема, наслідки якої необхідно передбачити. Можливо, що, створюючи стійкість у рослин, стимулюється процес відбору стійкіших збудників і шкідників. Природно, що трансгенезу викликає досить відчутні наслідки, які потрібно ретельно вивчати.

Генна терапія. Генну терапію на сучасному етапі можна визначити як лікування спадкових, мультифакторіальних і неспадкових (інфекційних) захворювань шляхом введення генів у клітини пацієнтів з метою спрямованого зміни генних дефектів або додання клітинам нових функцій.

Принципи генної терапії. Залежно від способу введення екзогенних ДНК в геном пацієнта генна терапія може проводитися або в культурі клітин (ex vivo), або безпосередньо в організмі (in vivo). Клітинна генна терапія або терапія ex vivo припускає виділення і культивування специфічних типів клітин пацієнта, введення в них чужорідних генів, відбір трансфекованих клітин і реінфузію їх тому ж пацієнтові (ріс.59). В даний час в більшості допущених до клінічних випробувань програм генної терапії використовується саме цей підхід.

Ріс.59. Генотерапія способом ex vivo. Клітини отримують від пацієнта, культивують in vitro, проводять їх генетичну трансформацію, відбирають потрібні клони клітин і повертають в організм пацієнта. У разі пухлин клітини трансформують генами, різко підсилюють імунну відповідь організму, опромінюють і трансплантують підшкірно того ж пацієнтові.

Генна терапія in vivo заснована на прямому введенні клонованих і певним чином упакованих послідовностей ДНК в специфічні тканини хворого. Особливо перспективним для лікування генних хвороб in vivo є встановлення генів за допомогою аерозольних або ін'еціруемих вакцин. Аерозольна генотерапія розробляється, як правило, для лікування пульмонологічних захворювань (муковісцидоз, рак легенів).

Розробці програми генної терапії передують ретельний аналіз тканеспецифической експресії відповідного гена, ідентифікація первинного біохімічного дефекту, дослідження структури, функції і внутрішньоклітинного розподілу його білкового продукту, а також біохімічний аналіз патологічного процесу. Всі ці дані враховуються при складанні відповідного медичного протоколу. Апробацію процедури генокоррекціі спадкового захворювання проводять на первинних культурах клітин хворого, в яких в нормі функціонально активний даний ген. На цих клітинних моделях оцінюють ефективність обраної системи перенесення екзогенної ДНК, визначають експресію вводиться генетичної конструкції, аналізують її взаємодія з геномом клітини, відпрацьовують способи корекції на біохімічному рівні.

Використовуючи культури клітин, можна розробити систему адресної доставки рекомбінантних ДНК, проте перевірка надійності роботи цієї системи може бути здійснена тільки на рівні цілого організму. Тому така увага в програмах з генної терапії приділяється експериментів in vivo на природних або штучно отриманих моделях відповідних спадкових хвороб у тварин. Успішна корекція генетичних дефектів у таких тварин і відсутність небажаних побічних ефектів генної терапії є найважливішою передумовою для дозволу клінічних випробувань.

Таким чином, стандартна схема генокоррекціі спадкового дефекту включає серію послідовних етапів. Вона починається створенням повноцінно працює (Експресується) генетичної конструкції, що містить смислове (кодує білок) і регуляторну частини гена. На наступному етапі вирішується проблема вектора, що забезпечує ефективну, а по можливості і адресну доставку гена в клітини-мішені. Потім проводиться трансфекція (перенесення отриманої конструкції) в клітини-мішені, оцінюється ефективність трансфекції, ступінь коррегіруемості первинного біохімічного дефекту в умовах клітинних культур (in vitro) і, що особливо важливо, in vivo на тваринах - біологічних моделях. Тільки після цього можна приступати до програми клінічних випробувань.

Генна терапія ex vivo і in vivo. Перші клінічні випробування методів генної терапії були зроблені 22 травня 1989 року з метою генетичного маркування пухлина-инфильтра лімфоцитів в разі прогресуючої меланоми. Першим моногенним спадковим захворюванням, щодо якої були застосовані методи генної терапії, виявився спадковий іммуннодефіціт, обумовлений мутацією в гені аденозіндезамінази (ADA). 14 вересня 1990 року в Бетесді (США) чотирирічної дівчинці, яка страждає цим досить рідкісним захворюванням (1: 100000), були пересаджені її власні лімфоцити, попередньо трансформовані поза організмом (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровірусний вектор). Лікувальний ефект спостерігався протягом декількох місяців, після чого процедура була повторена з інтервалом 3-5 місяців. За три роки терапії в цілому проведені 23 внутрішньовенні трансфузии ADA-трансформованих Т-лімфоцитів без видимих ??несприятливих ефектів. В результаті лікування стан пацієнтки настільки поліпшився, що вона змогла вести нормальний спосіб життя і не боятися випадкових інфекцій. Настільки ж успішним виявилося і лікування другої пацієнтки з цим захворюванням. В даний час клінічні випробування генної терапії цього захворювання проводяться в Італії, Франції, Великобританії та Японії.

У 1997 році число допущених до клінічних випробувань протоколів вже становило 175, понад 2000 пацієнтів взяли участь в їх реалізації. Більшість таких проектів (близько 80%) стосуються лікування онкологічних захворювань, а також ВІЛ-інфекції (СНІДу). Разом з тим і в сучасних дослідженнях з генної терапії необхідно враховувати, що наслідки маніпулювання генами або рекомбінантними ДНК in vivo вивчені недостатньо.

У країнах з найбільш просунутим рівнем досліджень в цій області, особливо в США, медичні протоколи з використанням смислових послідовностей ДНК піддаються обов'язковій експертизі у відповідних комітетах і комісіях.

Вірусні та невірусні вектори в генотерапіі. Вирішальною умовою успішної генотерапії є забезпечення ефективної доставки, тобто трансфекції (в широкому сенсі) або трансдукції (при використанні вірусних векторів) чужорідного гена в клітини-мішені, забезпечення тривалого функціонування його в цих клітинах і створення умов для повноцінної роботи гена (його експресії) . Трансфекція може проводитися з використанням чистої ( «голої» - naked) ДНК, легованої (вбудованої) в відповідну плазміду, або комплексірованние ДНК (плазмідна ДНК, поєднана з солями, білками (трансферин), органічними полімерами (DEAE-декстран, полілізін, ліпосомами або частинками золота), або ДНК в складі вірусних частинок, попередньо позбавлених здатності до реплікації.

Основні методи доставки чужорідних генів в клітини поділяються на хімічні, фізичні та біологічні. Тільки вірусні вектори або генетичні конструкції, що включають вірусні послідовності, здатні до активної трансдукції, а в деяких випадках і до тривалої експресії чужорідних генів. З понад 175 вже схвалених протоколів клінічних випробувань з генотерапіі понад 120 припускають використовувати вірусну трансдукції і близько 100 з них засновані на застосуванні ретровірусних векторів.

Огляд літературних даних дозволяє прийти до висновку, що, незважаючи на зусилля багатьох лабораторій світу, все вже відомі і випробувані in vivo і in vitro векторні системи далекі від досконалості. Якщо проблема доставки чужорідної ДНК in vitro практично вирішена, а її доставка в клітини-мішені різних тканин in vivo успішно вирішується (головним чином шляхом створення конструкцій, що несуть ре-цепторние білки, в тому числі і антигени, специфічні для тих чи інших тканин), то інші характеристики існуючих векторних систем - стабільність інтеграції, регульована експресія, безпека - все ще потребують серйозних доопрацювань.

Перш за все, це стосується стабільності інтеграції. До теперішнього часу інтеграція в геном досягалася тільки при використанні ретровірусних або аденоассоціірованних векторів. Підвищити ефективність стабільної інтеграції можна шляхом вдосконалення генних конструкцій типу рецептор-опосередкованих систем (ріс.60) або шляхом створення досить стабільних епісомних векторів (тобто ДНК-структур, здатних до тривалої персистенції всередині ядер).

Ріс.60. Рецептор-опосередкований перенесення гена. ДНК-послідовність потрібного гена з'єднують з певним мембранним рецептором (наприклад, сіалоглікопротеіном в разі клітин печінки), а також з аденовирусом, що забезпечує проникнення генної конструкції в ядро ??клітини. Такий комбінований вектор забезпечує ефективну адресну доставку гена в клітини печінки.

Останнім часом особлива увага приділяється створенню векторів на базі штучних хромосом ссавців. Завдяки наявності основних структурних елементів звичайних хромосом такі міні-хромосоми довгостроково утримуються в клітках і здатні нести повнорозмірні (геномні) гени і їх природні регуляторні елементи, які необхідні для правильної роботи гена, в потрібній тканини і в належний час.

Перспективи та обмеження генної терапії. Успіх перших клінічних випробувань з'явився потужним стимулом для прискорення розвитку нових генотерапевтіческіх методів стосовно до інших спадкових хвороб

Поява принципово нових технологій, що дозволяють активно маніпулювати з генами і їх фрагментами і забезпечують адресну доставку нових блоків генетичної інформації в задані ділянки геному, стало важливою подією в біології та медицині. Вже зараз на сучасному рівні знань про геном людини теоретично цілком можливі такі його модифікації з метою поліпшення деяких фізичних (наприклад, зростання), психічних та інтелектуальних параметрів. Таким чином, сучасна наука про людину на своєму новому витку розвитку повернулася до ідеї поліпшення людської породи, колись постульованої видатним англійським генетиком Ф. Гальтон і розвиненою його учнями і послідовниками в Великобританії (К. Пірсон, Л. Пенроуз, Дж. Холдейн) , в Росії (Н. К. Кольцов, Ф. П. Філіпченко), в США (Г. Меллер). Подальший хід історії, як відомо, повністю дискредитував саму ідею поліпшення людської породи. Однак майбутнє всевладдя людини над власним геномом змушує знову і знову повертатися до цієї теми, робить її предметом постійних жвавих дискусій в широкій і науковій пресі. Можна не сумніватися, що початкові побоювання, пов'язані з генною інженерією людини, були невиправдані. Вже визнано доцільним застосування генної терапії для лікування багатьох захворювань. Єдиним і неодмінним обмеженням, яке зберігає свою силу і в сучасних умовах, є те, що всі генотерапевтіческіе заходи повинні бути спрямовані тільки на конкретного хворого і стосуватися виключно його соматичних клітин.

Генна інженерія можлива на рівні зародкових клітин. Профілактика спадкових хвороб може бути найбільш повною й ефективною, якщо в зиготу буде вбудований ген, по функції замінює мутантний ген. Усунення причини спадкової хвороби (а саме це і є найбільш глибокий підхід до профілактики) означає досить серйозне «маневрування» з генетичною інформацією в зиготі. Це можуть бути введення нормального алеля в геном шляхом трансфекції, зворотна мутація патологічного алеля, «включення» нормального гена в роботу, якщо він блокований, "виключення" мутантного гена. Складнощі цих завдань очевидні, що не інтенсивні експериментальні розробки в галузі генної інженерії свідчать про принципову можливість їх вирішення. Питання про генно-інженерної профілактики спадкових хвороб є вже не утопією, а перспективою, хоча і не близької.

Передумови для корекції генів людини в зародкових клітинах вже створені. Їх можна узагальнити у вигляді наступних положень.

Первинна розшифровка генома людини завершена, особливо на рівні секвенування нормальних і патологічних алелей. Можна сподіватися, що для більшості спадкових хвороб мутації будуть секвенувати в найближчі роки. Інтенсивно розвивається функціональна геноміка, завдяки якій будуть відомі міжгенних взаємодії.

Будь-які гени людини неважко отримувати в чистому вигляді на основі хімічного або біологічного синтезу. Цікаво відзначити, що ген глобіну людини був одним з перших штучно отриманих генів.

Розроблено методи включення генів в геном людини з різними векторами або в чистому вигляді шляхом трансфекції.

Методи спрямованого хімічного мутагенезу дозволяють індукувати специфічні мутації в строго певному локусі (отримання зворотних мутацій - від патологічного алеля до нормального).

Отримані докази в експериментах на різних тварин трансфекції окремих генів на стадії зигот (дрозофіла, миша, коза, свиня і ін.). Введені гени функціонують в організмі-реципієнта і передаються у спадок, хоча і не завжди за законами Менделя. Наприклад, ген гормону росту щурів, введений в геном зигот мишей, функціонує у народжених мишей. Такі трансгенні миші значно більше за розмірами і масою в порівнянні з нормальними.

Генно-інженерна профілактика спадкових хвороб на рівні зигот розроблена поки слабо, хоча вибір способів синтезугенів і способів їх «доставки» в клітини вже досить широкий. Вирішення питань трансгенозу у людини сьогодні впирається не тільки в генно-інженерні труднощі, але і в етичні проблеми. Адже мова йде про «композиції» нових геномів, які створюються не еволюцією, а людиною. Ці геноми увіллються в генофонд людства. Якою буде їхня доля з генетичної та соціальної точки зору? Чи будуть вони функціонувати як нормальні геноми? Чи готове суспільство прийняти на себе наслідки невдалого? Сьогодні відповісти на ці питання важко, а без відповіді на них не можна починати клінічні випробування. Адже мова йде про безповоротній втручанні в геном людини. Без об'єктивної оцінки еволюційних наслідків генної інженерії не можна застосовувати ці методи на людину (навіть і з медичними цілями на стадії зигот). Генетика людини ще далека від повного розуміння всіх особливостей функціонування генома. Неясно, як геном буде працювати після введення в нього додаткової генетичної інформації, як він буде вести себе після мейозу, редукції числа хромосом, в поєднанні з новою зародкової клітиною і т.п.

Все сказане вище дало підставу фахівцям в області біомедичної етики на міжнародному рівні, включаючи ВООЗ, ЮНЕСКО, Рада Європи, тимчасово утриматися від проведення експериментів, а тим більше клінічних випробувань з трансгеноз зародкових клітин.

Сучасний рівень знань не дозволяє проводити корекцію генних дефектів на рівні статевих клітин і клітин ранніх доімплантаційних зародків людини в зв'язку з реальною небезпекою засмічення генофонду небажаними штучними генними конструкціями або внесенням мутацій з непередбачуваними наслідками для майбутнього людства. Разом з тим у науковій літературі все частіше і наполегливіше лунають заклики до відновлення дискусії про доцільність генокоррекціі зародкових і статевих клітин людини.

Ось деякі питання, які повинні бути вирішені в рамках пропонованої генетиками широкої дискусії з генної терапії.

Чи зможе в майбутньому генна терапія забезпечити настільки повноцінну генокоррекціі, яка не надасть загрози для потомства?

Якою мірою корисність і необхідність генотерапевтіческой процедури для однієї подружньої пари переважать ризик такого втручання для всього людства?

Наскільки виправдані будуть ці процедури на тлі прийдешнього перенаселення планети?

Як будуть співвідноситися генно-інженерні заходи на людину з проблемами гомеостазу суспільства і біосфери?

Таким чином, генетична революція, апофеозом якої стала генотерапія, не тільки пропонує реальні шляхи лікування тяжких спадкових і неспадкових недуг, але і в своєму стрімкому розвитку ставить перед суспільством нові проблеми, вирішення яких настійно необхідно вже в найближчому майбутньому.

Генні вакцини (ДНК-вакцини). Використовувані сьогодні вакцини можна розділити в залежності від методів їх отримання на наступні типи:

· Живі аттенуіровані вакцини;

· Інактивовані вакцини;

· Вакцини, що містять очищені компоненти мікроорганізмів;

· Рекомбінантні вакцини, що містять компоненти мікроорганізмів,
 отримані методом генної інженерії.

Технологію рекомбінантної ДНК застосовують також для створення живих ослаблених вакцин нового типу, досягаючи аттенуации шляхом спрямованих мутацій генів, що кодують вірулентні протеїни збудника захворювання. Цю ж технологію використовують і для отримання живих рекомбінантних вакцин, вставляють гени, що кодують імуногенні протеїни, в живі непатогенні віруси або бактерії (вектори), які і вводять людині. У 1990р. в деяких дослідницьких лабораторіях приступили до розробки нових вакцин, які засновані на введенні «голої» молекули ДНК. Уже в 1992-1993 рр. кілька незалежних груп дослідників в результаті експерименту довели, що введення чужорідної ДНК в організм тварини сприяє формуванню імунітету. Принцип застосування ДНК-вакцин полягає в тому, що в організм пацієнта вводять молекулу ДНК, що містить гени, що кодують імуногенні білки патогенного мікроорганізму. ДНК-вакцини називають ще генними, генетичними, полинуклеотидной вакцинами, вакцинами з нуклеїнових кислот.

На нараді фахівців з генним вакцин, проведеному в 1994 році під егідою ВООЗ, було вирішено віддати перевагу терміну «вакцини з нуклеїнових кислот» з їх підрозділом відповідно на ДНК - і РНК - вакцини. Таке рішення ґрунтувалося на тому, що вживання терміна «ДНК - вакцина» не сформує помилкова думка про те, що нові вакцини вносять зміни в генетичні структури організму вакцинируемого людини. Проте, багато фахівців вважають більш точним термін «генні вакцини» (оскільки імунна реакція спрямована не проти ДНК, а проти антигенного білка, що кодується геном), який також часто застосовують. Для отримання ДНК-вакцин ген, який кодує продукцію імуногенною протеїну будь-якого мікроорганізму, вбудовують в бактеріальну плазміду. Крім гена, що кодує вакцинують протеїн, в плазміду вбудовують генетичні елементи, які необхідні для експресії ( «включення») цього гена в клітинах еукаріотів, в тому числі людини, для забезпечення синтезу білка. Таку плазмиду вводять в культуру бактеріальних клітин, щоб отримати велику кількість копій. Потім плазмидную ДНК виділяють з бактерій, очищують від інших молекул ДНК і домішок. Очищена молекула ДНК і служить вакциною.

Введення ДНК-вакцини забезпечує синтез чужорідних протеїнів клітинами вакцинируемого організму, що призводить до подальшої виробленні імунітету проти відповідного збудника. При цьому плазміди, що містять відповідний ген, не вбудовуються в ДНК хромосом людини. ДНК-вакцини можна вводити в сольовому розчині звичайним парентеральним способом (внутрішньом'язово, внутрішньошкірно). При цьому велика частина ДНК надходить у міжклітинний простір і тільки після цього включається в клітини. Застосовують і інший метод введення, використовуючи так званий генний пістолет. Для цього ДНК фіксують на мікроскопічних золотих гранулах (близько 1-2 мкм), потім за допомогою пристрою, що приводиться в дію стисненим гелієм, гранули «вистрілюють» безпосередньо всередину клітин. Слід зазначити, що аналогічний принцип введення ліків за допомогою струменя стиснутого гелію використовують і для розробки нових способів доставки лікарських засобів (з цією метою оптимізують розміри частинок лікарської речовини і їх щільність для досягнення необхідної глибини проникнення в відповідну тканину організму). Цей метод вимагає дуже невеликої кількості ДНК для імунізації. Якщо при імунізації класичними суб'едінічнимі вакцинами вводять мікрограми протеїну, то при використанні ДНК-вакцини - нанограми і навіть менше. Говорячи про мінімальну кількість ДНК, достатній для індукції імунної відповіді, С. А. Джонстон, директор Центру біомедичних винаходів Техаського університету, в журналі «The Scientist» (1998) зазначає, що за допомогою генного пістолета можна одноразово ввести миші «фактично 27 тис. різних плазмід і отримати імунну відповідь на індивідуальну плазміду ». Наступні експерименти підтвердили здатність ДНК-вакцин формувати імунітет щодо різноманітних збудників. ДНК-вакцини мають ряд переваг в порівнянні з традиційними вакцинами.

Усвідомлення перспективність застосування генних вакцин сприяло значному збільшенню фінансування досліджень в цьому напрямку не тільки з боку державних організацій, а й приватних компаній. Характерним прикладом може служити невелика американська біотехнологічна фірма «Vical Inc.», яка однією з перших приступила до розробки ДНК-вакцин. Спонукальним фактом для роботи в цьому напрямку послужили результати одного експерименту, проведеного в лабораторії «Vical Inc.» в 1989р., Коли дослідники випадково встановили, що введення «голої» вірусної ДНК мишам призводить до продукції великої кількості вірусних білків. Після цього фірма запатентувала метод прямого введення «голої» ДНК в клітини. Уже в 1991 р. «Vical Inc.» приступила до розробки ДНК-вакцин для попередження інфекційних захворювань. Через 2 роки в журналі «Science» були опубліковані результати цих досліджень, які підтверджують ефективність застосування ДНК-вакцини проти грипу у мишей. Незабаром компанія «Vical Inc.» почала розробки виробництва і продажу терапевтичних та профілактичних ДНК-вакцин проти ВІЛ / СНІДу, туберкульозу, гепатиту В, гепатиту С, герпесу та захворювань, що викликаються вірусами папіломи людини. Інший найбільший виробник вакцин - компанія «Aventis Pasteur» - розробляє ДНК-вакцини, що попереджають інфікування цитомегаловірусом, збудником малярії, Н. pylori, респіраторно-синцитіальним вірусом, вірусом вітряної віспи та ін.

Компанія «Vical Inc.» проводить також клінічні дослідження (I або II фаза) терапевтичних вакцин і методів генної терапії (на основі технології «голої» ДНК) для лікування хворих з деякими злоякісними новоутвореннями. ДНК-вакцини мають великий потенціал і можуть викликати революцію в вакцинологии. Однак багато фахівців не поспішають робити остаточні висновки до тих пір, поки не отримають достатню кількість даних клінічних досліджень, переконливо свідчать про ефективність і безпеку ДНК-вакцин. У найближчі кілька років не слід очікувати їх впровадження в медичну практику, оскільки більшість з розроблюваних вакцин знаходиться на етапі доклінічних або проходять I-II фазу клінічних досліджень.

Генотерапія в онкології. Одночасно з розвитком досліджень в області генокоррекціі спадкових дефектів успішними також виявилися пошуки методів терапевтичного використання смислових послідовностей ДНК для лікування неспадкових захворювань і, головним чином, злоякісних пухлин і вірусних інфекцій. Істотно, що саме в цих розділах патології пошуки шляхів генокоррекціі проводяться особливо інтенсивно, а число вже схвалених протоколів клінічних випробувань у багато разів перевищує число таких для лікування моногенних хвороб.

Основні методологічні підходи до генотерапіі різних пухлин, цілком застосовні і для боротьби з наибо


Організація геномів неклітинних і клітинних організмів | ДНК-геноми | геном бактерій | Особливості плазмід. | Організація геному еукаріот. | Молекулярні механізми генних, хромосомних і геномних мутацій | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 1 сторінка | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 2 сторінка | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 3 сторінка | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 4 сторінка |

загрузка...
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати