загрузка...
загрузка...
На головну

Дослідження нуклеїнових кислот. Методи ДНК-діагностики

  1. II. ВІДЧУТТЯ. ДОСЛІДЖЕННЯ ВІДЧУТТІВ психофізичного МЕТОДАМИ
  2. III. Монографіческоеі порівняльне дослідження.
  3. III. ФІЗИЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
  4. III. Етапи, регламент i методика правядзення дзелавой гульнi
  5. IX. дослідження мови
  6. Part II. Methods and Means / методи і засоби
  7. VII. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-психологічні методи дослідження МИСЛЕННЯ І МОВИ

Методи дослідження нуклеїнових кислот. Методи виділення ДНК з рослинних і тваринних тканин і її очищення. Ферменти, що використовуються для генно-інженерних досліджень. Рестріктази. ДНК-зонди. Електрофорез ДНК. Ідентифікація фрагментів ДНК і РНК методами гібридизації. Саузерн-, Норзерн-, Вестерн-блот. Клонування фрагментів нуклеїнових кислот in vitro. Полімеразна ланцюгова реакція. Секвенування ДНК.

Методи ДНК-діагностики. Показання до ДНК-діагностики. Прямі та непрямі методи. ДНК-чіпи. Молекулярно-генетичні методи дослідження в судовій медицині.

Методи дослідження нуклеїнових кислот.Молекулярно-генетичні методи - велика і різноманітна група методів, в кінцевому рахунку, призначених для виявлення варіацій в структурі досліджуваної ділянки ДНК (алелі, гена, регіону хромосоми) аж до розшифровки первинної послідовності основ. В основі цих методів лежать «маніпуляції» з ДНК і РНК. В результаті бурхливого розвитку молекулярної генетики людини в 70-80-х роках і подальшого успішного вивчення генома людини молекулярно-генетичні методи широко увійшли в медико-генетичну практику.

Щоб познайомити з суттю і термінологією молекулярно-генетичних методів, нижче схематично описані їх основні етапи та варіанти. Освоєння цих методів, як і інших методів лабораторної діагностики, вимагає спеціальної підготовки у відповідних лабораторіях.

Отримання зразків ДНК (або РНК) Є вихідним етапом всіх методів. Цей етап реалізується в двох варіантах: а) виділення всієї ДНК (тотальної або геномної) з клітин; б) накопичення певних фрагментів, які передбачається аналізувати, за допомогою ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція).

Джерелом геномної ДНК можуть бути будь-які ядерні клітини. Виділена з клітин ДНК являє собою весь геном організму, тому такі зразки називають геномної ДНК. На практиці частіше використовують периферичну кров (лейкоцити), хоріон, амніотичні клітини, культури фібробластів. Для одного аналізу необхідно мати (у залежності від використовуваного методу) від декількох нанограммов до декількох мікрограмів ДНК. Для цього потрібно дійсно невелика кількість біологічного матеріалу, наприклад 20-40 мг хоріона, 1 мл крові, 5-10 мг культури клітин. Для здійснення деяких методів досить мати 1 краплю крові, зішкріб епітелію з щоки або кілька волосяних цибулин. Можливість проведення молекулярно-генетичного аналізу з невеликою кількістю доступного біологічного матеріалу є методичним перевагою методів названої групи. До цього ще можна додати, що виділена ДНК однаково придатна для проведення різних варіантів методів і може довго зберігатися в замороженому вигляді.

Для виділення ДНК використовують різні методики залежно від поставлених завдань. Їх суть полягає в екстракції (витягу) ДНК з біопрепарату і видаленні або нейтралізації сторонніх домішок для отримання препарату ДНК з чистотою, придатною для постановки ПЛР.

Іноді буває досить прокип'ятити зразок протягом 5-10 хв., Проте в більшості випадків потрібні складніші методи.

Стандартної і тепер класичною вважається методика отримання чистого препарату ДНК по мармуру. Вона включає в себе ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацією і переосажденіем ДНК спиртом. Цей метод дозволяє отримати чистий препарат ДНК. Однак він досить трудомісткий і передбачає роботу з такими агресивними і мають різкий запах речовинами, як фенол і хлороформ.

Одним з популярних в даний час є метод виділення ДНК, запропонований Boom з співавторами. Цей метод заснований на використанні для лізису клітин сильного хаотропного агента - гуанидина тіоционату (GuSCN), і подальшої сорбції ДНК на носії (скляне намисто, діатомова земля, скляне «молоко» і. Т. Д.). Після отмивок в пробі залишається ДНК, сорбированная на носії, з якого вона легко знімається за допомогою елюіруются буфера. Метод зручний, технологічний і придатний для підготовки зразка до ампліфікації. Однак можливі втрати ДНК внаслідок незворотною сорбції на носії, а також в процесі численних отмивок. Особливо велике значення це має при роботі з невеликими кількостями ДНК в зразку. Крім того, навіть слідові кількості GuSCN можуть пригнічувати ПЛР. Тому при використанні цього методу дуже важливим є правильний вибір сорбенту і ретельне дотримання технологічних нюансів. Слід зазначити, що через велику кількість стадій додавання і видалення розчинів при роботі зі зразком потрібно акуратність, т. К. Можлива перехресна контамінація між пробами утворюється аерозоль ДНК.

Інша група методів пробопідготовки заснована на використанні ионообменников типу Chilex, які, на відміну від скла, сорбують чи не ДНК, а навпаки, домішки, що заважають реакції. Як правило, ця технологія включає дві стадії: кип'ятіння зразка і сорбція домішок на іонообміннику. Метод надзвичайно привабливий простотою виконання. У більшості випадків він придатний для роботи з клінічним матеріалом. На жаль, іноді зустрічаються зразки з такими домішками, які неможливо видалити за допомогою ионообменников. Крім того, деякі мікроорганізми не піддаються руйнуванню простим кип'ятінням. У цих випадках необхідне введення додаткових стадій обробки зразка.

При масовому скринінгу, коли важливо отримати статистичні дані, можливо використання простих методів із застосуванням детергентів або обробки біологічного матеріалу лугами з подальшою їх нейтралізацією. У той же час, використання подібних методів пробопідготовки для клінічної діагностики може призводити до хибнонегативним результатами, внаслідок використання в реакційній суміші неякісного препарату ДНК.

Таким чином, до вибору методу пробоподготовки слід ставитися з розумінням цілей проведення передбачуваних аналізів.

Зразки тканин, одержувані при хірургічних операціях, зазвичай фіксують формаліном і заливають в парафін. Такі фіксовані препарати також можуть використовуватися для проведення ПЛР.

Ферменти, що використовуються для генно-інженерних досліджень. рестріктази. Одним з найважливіших інструментів генної інженерії є ендонуклеази - ферменти, що розщеплюють ДНК за специфічними послідовностям нуклеотидів всередині ланцюга. Ці ферменти отримали назву рестриктаз. Рестріктази розщеплюють ДНК на відносно невеликі фрагменти в ділянках строго визначених послідовностей. Цим їх вплив відрізняється від більшості інших ферментативних, хімічних або фізичних впливів, що призводять до випадкових розривів ланцюгів ДНК. Рестріктази (вже відкрито понад 200 типів ферментів цього класу) є частиною захисної системи бактерій, які охороняють власний геном від чужорідної, головним чином вірусної ДНК. Рестріктази прийнято називати за назвою бактерій, з яких їх виділяють. Так, назва EcoRI свідчить про те, що цей фермент з Esherichia coli, ВатН1 - з Bacillus amilolquefacientsi. Кожен фермент дізнається певну 4-7-членну послідовність в двухцепочечной ДНК. Розрізання ДНК по цих сайтів призводить до утворення або «тупих» (наприклад, при дії рестриктаз Hpal), або «липких», тобто перекриваються (наприклад, ВатН1),-решт. Для конструювання гібридних молекул особливо зручні липкі кінці. Будь-фрагмент ДНК має характерний розташуванням сайтів впізнавання різних рестриктаз, що дозволяє будувати так звані рестріктазного карти. При розщепленні ДНК будь-якої однієї рестриктазой отримують суміш фрагментів, кожен з яких має одні й ті ж кінцеві ділянки. Такі фрагменти можна розділити і ідентифікувати методом електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі.

Частина ферментів, що застосовуються для дослідження ДНК, представлена ??в таблиці 10.

ДНК-зонди. Інформація про все різноманітті організму укладена в його генетичному матеріалі. Так патогенність бактерій визначається наявністю в них специфічного гена або набору генів, а спадкове генетичне захворювання виникає в результаті пошкодження певного гена. Сегмент ДНК детермінують даний біологічний ознака має строго певну послідовність і може служити діагностичним маркером.

В основі багатьох швидких і надійних діагностичних методів лежить гібридизація нуклеїнових кислот - спаровування двох компліментарних сегментів різних молекул ДНК.

Табл.10. Основні ферменти, які використовуються в генній інженерії

 фермент  реакція  область додатків
 рестріктази  Розщеплюють ДНК за специфічними послідовностям нуклеотидів  Отримання фрагментів ДНК, створення химерних молекул ДНК
 нуклеаза  Деградація як 5'-, так і 3 '-кінців ДНК  Освіта кінцевих делецій в молекулах ДНК
 ДНК-лігаза  Каталізує утворення зв'язків між молекулами ДНК  «Зшивання» фрагментів ДНК
 ДНК-полімераза I  Синтез двухцепочечной ДНК по ДНК-матриці  Синтез двухцепочечной ДНК
 ДНКаза1  Вносить одноцепочечниє розриви в ДНК  Картування ділянок в ДНК
 Екзонуклеаза-Ш  Видаляє нуклеотиди з 3 '-кінців ДНК  секвенування ДНК
 екзонуклеаза  Видаляє нуклеотиди з 5-решт ДНК.  секвенування ДНК
 Зворотній транскриптаза  Синтезує ДНК по РНК-матриці  Синтез кДНК по мРНК: картування ДНК
   

У діагностичних тестах, заснованих на гібридизації нуклеїнових кислот, ключовими є три компоненти: ДНК-зонд, ДНК-мішень і метод детекції гібридизаційного сигналу.

Система детекції повинна бути найвищою мірою своєрідною і високочутливої.

Щоб забезпечити адекватність діагностичного тесту гібридизаційним ДНК і РНК-зонди повинні бути Високоспецифічні. Іншими словами необхідно, щоб зонд гібрідізоваться тільки з шуканої нуклеотидной послідовністю. Якщо є ймовірність отримання ложноположительного (наявність гібридизаційного сигналу в відсутності послідовності мішені) або помилково негативні (відсутність сигналу при наявності послідовності - мішені) результату, то доцільність застосування тесту значно знижує специфічність зондів, яка може проявлятися на різних рівнях: вони можуть «розрізняти» два і більше виду, окремі штами в межах одного виду або різні гени. Залежно від ситуації зонди можуть бути представлені молекулами ДНК і РНК; вони можуть бути довгими (більше 100 нуклеотидів) або короткими (менше 50 нуклеотидів), являють собою продукт хімічного синтезу, клоновані інтактних гени або їх фрагменти.

Зонди отримують різними способами. Один з них полягає в наступному. ДНК патогенного мікроорганізму розщеплюють за допомогою рестріцірующей ендонуклеази і клонують в плазмідними векторі. Потім проводять скринінг рекомбінантних плазмід з використанням геномної ДНК як патогенного, так і непатогенного штамів. Ті плазміди, які містять послідовності, гібридизується тільки з ДНК патогенного штаму, складають основу видоспецифических зондів. Після цього проводять ряд додаткових гібридизації з ДНК, виділеними з різних організмів, щоб упевнитися, що потенційні зонди не дають з ними перехресної гібридизації для визначення чутливості методу кожен з зондів перевіряють також на модельних зразках, в тому числі і на змішаних культурах. Дуже бажано, щоб ДНК-діагностику можна було проводити на початковому матеріалі, без додаткового його культивування або виділення нуклеїнових кислот, особливо в тих випадках, коли тестуються клінічні зразки. Дослідники з успіхом проводять гібридизацію з ДНК мішенями, присутніми в зразках калу, сечі, крові, змивах із зіву і тканинах без попередньої їх очистки. Якщо концентрація послідовності мішені в досліджуваному зразку занадто мала, її можна ампліфіціравать за допомогою ПЛР.

Як приклад використання ДНК-зонда для діагностики захворювань можна привести процедуру виявлення Plasmodium falciparum. Цей паразит викликає малярію, захворювання, яке загрожує приблизно третини всього населення Землі. Він інфікує еритроцити і руйнує їх, що призводить до розвитку лихоманки, а у важких випадках до поразки мозку, нирок та інших органів. Щоб виявити джерела інфекції, оцінити ефективність заходів щодо їх ліквідації та забезпечити ранню діагностику і лікування, необхідно досить чутливі, прості і недорогі методи. В даний час малярію діагностують за допомогою мікроскопічного дослідження мазків крові - ефективного, але трудомісткого і займає багато часу процесу. Імунологічні методи виявлення Plasmodium, такі як ELISA, досить швидкі і їх легко автоматизувати, але з їх допомогою можна відрізнити поточну інфекцію від минулої, оскільки при цьому визначаються тільки наявність антитіл до Plasmodium в крові хворого. Для виборчої ДНК-діагностики поточної інфекції, т. Е. Для виявлення ДНК-збудника, в якості основи використовують високоповторяющіеся послідовності ДНК Plasmodium falciparum. Спочатку за допомогою ДНК-зонда проводять скринінг бібліотеки геномної ДНК паразита. Потім відбираються клони дають найбільш інтенсивний гібрідізаціонний сигнал, оскільки саме вони імовірно містять високоповторяющіеся послідовності. ДНК кожного з відібраних клонів перевіряють на здатність до гібридизації з ДНК видів Plasmodium, що не викликають малярію. Як специфічний зонда вибирається послідовність гибрідизуючою ДНК з Plasmodium falciparum, але не з ДНК Plasmodium vivax, Plasmodium cynomolgi або з ДНК людини. З його допомогою можна виявити лише 10 пг очищеної ДНК Plasmodium falciparum або 1 нг тієї ж ДНК в крові хворого.

Отримано і охарактеризовано понад 100 різних ДНК-зондів,
 дозволяють виявляти патогенні штами різних бактерій, вірусів і паразитичних найпростіших. Так є зонди для діагностики бактеріальних інфекцій людини, що викликаються Legionella рheumoniae (респіраторні захворювання), Salmonella typhimurium (харчове отруєння), Campylobacter hyointestinalis (racтріти), a також для виявлення ентеротоксічного штаму Escherichia coli (гастроентериту) проте це лише «верхівка айсберга»; в принципі за допомогою гібридизації можна виявляти практично будь-які патогенні мікроорганізми.

У більшості лабораторій для гібридизації використовують зонди, мічені будь-яким радіоактивним ізотопом, найчастіше 32Р. Такі зонди мають високу питомою радіоактивністю і забезпечують хороші відношення сигнал / шум. Радіоактивний мічений зонд наносять на фільтр з фіксованою на ньому ДНК-мішенню, проводять гібридизацію, відмивають незв'язані ДНК-зонд і детектируют мітку за допомогою радиоавтографии.

Однак 32Р є короткоживущим ізотопом, що випускає високоенергетичне випромінювання; при роботі з ним необхідно використовувати спеціальне обладнання та забезпечити безпечну утилізацію відходів. Щоб обійти ці труднощі, були створені не радіоактивні системи детекції. Для посилення гібридизаційного сигналу в цьому випадку використовується ферментативне перетворення хромогенного або хемілюмінесцентного субстрату: перший з них під дією ферменту змінюють забарвлення, а другий - випромінює світло.

Один з недавно розроблених нерадіоактивних методів детекції заснований на використанні зонда - «молекулярного маяка».

Такий зонд складається з 25 нуклеотидів. До 5 'кінця приєднаний флуоресцентний хромофор, а до 3' кінця - НЕ флуоресцентний хромофор, на який передається енергія збудження флуорофора. У розчині при кімнатній температурі маяк має таку конфігурацію, при якій флуорофор і гасників перебувати в тісному контакті і флуоресценція флуорофора гаситься. Коли 15 середніх нуклеотидів зонда гибрідизуючою з комплементарної послідовністю ДНК і РНК-мішені, відбувається просторове розділення флуорофора і гасників і зонд випромінює світло. Необхідно також, щоб всі 15 нуклеотидів зонда були комплементарними відповідній послідовності ДНК і РНК-мішені.

Електрофорез фрагментів ДНК забезпечує поділ цих фрагментів при їх розподілі на поверхні агарозного або поліакріламідного гелю. Фрагменти ДНК рухаються в гелі, вміщеному в постійне електричне поле, від негативного полюса до позитивного в залежності від розмірів (чим більше відносна молекулярна маса фрагмента, тим повільніше він рухається в електричному полі). Після закінчення електрофорезу кожен фрагмент ДНК займає певне положення у вигляді дискретної смуги в конкретному місці гелю. Довжину кожного фрагмента можна визначити шляхом порівняння пройденого фрагментом відстані з відстанню, пройденим стандартним зразком ДНК з відомими розмірами.

ідентифікація фрагментів ДНК і РНК методами гібридизації в гелі є або кінцевим етапом діагностики, або необхідним елементом подальшого аналізу. Для ідентифікації і виділення, що цікавлять дослідника клонів бактерій з химерною ДНК розроблений метод гібридизації в бактеріальних колоніях. Для цього на численні колонії бактерії, вирощені на твердому середовищі, спочатку накладають нітроцелюлозний фільтр. Частина бактерій прилипає до фільтру. Після лізису клітин, денатурації і фіксування ДНК фільтр инкубируют в розчині з радіоактивно міченим зондом. Після закінчення гібридизації фільтр відмивають від надлишку зонда і виявляють утворився мічений гібридний комплекс шляхом контакту з рентгенівською плівкою. Порівнюючи положення плями на радіоавтографія з положенням колоній на чашці, вибирають ту з них, яка дала позитивний сигнал.

Всі різновиди методів гібридизації базуються на комплементарних взаємодіях азотистих основ різних ланцюгів нуклеїнових кислот. Точна відповідність послідовностей гибрідизуючою фрагментів призводить до швидкого утворення міцного стійкого комплексу.

В цілому методи гібридизаційного аналізу можна розділити на два типи:

· Методи гібридизаційного аналізу, що проводяться в розчині (гомологічні);

· Методи гібридизаційного аналізу, що проводяться на твердому носії (гетерогенні).

Метод гібридизації в розчині. При гібридизації в розчині шукана нуклеїнова кислота і зонд вільно взаємодіють у водному реакційної суміші, що підвищує швидкість процесу гібридизації. Детекцию результатів гібридизації в розчині здійснюють шляхом нуклеазного гідролізу одноланцюгових ДНК і виділення решти дволанцюжкових гібридів, що містять мічений зонд.

Для успішного проведення реакції гібридизації в розчині необхідно застосовувати одноцепочечниє зонди, нездатні до самогібрідізаціі. Метод гарний ще й тим, що вимагає мінімальних обсягів і кількостей біологічного і клінічного зразків, тому може бути використаний в діагностичних цілях. У той же час цей метод має один істотний недолік - на його основі можна створити діагностичні тест-системи для виявлення специфічних фрагментів невеликих ділянок ДНК за умови досить високої концентрації шуканих фрагментів або ділянок в досліджуваному зразку. Це знижує поріг чутливості до рівня імуноферментного аналізу і навіть нижче.

Метод гібридизації на твердому носії. Принцип методу заснований на гібридизації зонда на твердій поверхні. В якості твердої поверхні найчастіше використовують полімерний мембранний фільтр, наприклад, нейлонову мембрану.

У більшості випадків процедуру проведення аналізу можна розділити на наступні стадії: підготовка зразка (в тому числі екстракція і виділення ДНК), фіксація проби на носії, предгібрідізація, власне гібридизація, відмивання не пов'язана продуктів, детекция.

Для підготовки проби, може бути, необхідно попереднє «подращивание» досліджуваного матеріалу для ідентифікації окремих колоній бактерій або збільшення концентрації вірусів у клітинній культурі. Проводиться і безпосередній аналіз зразків клітин, сечі, уретральних зіскрібків, формених елементів крові або цільної крові на присутність інфекційних агентів. Для звільнення нуклеїнових кислот зі складу клітинних структур проводять лізис клітин, а в деяких випадках очищають препарат ДНК за допомогою фенолу. Денатурація ДНК, т. Е. Перехід в одноцепочечную форму, відбувається при обробці лугом. Потім зразок нуклеїнової кислоти фіксують на носії - нітроцелюлозній або нейлонової мембрані, зазвичай шляхом інкубації від 10 хв до 4 год при 80 ° С у вакуумі. Далі в процесі предгібрідізаціі досягається інактивація вільних місць зв'язування для зменшення неспецифічного взаємодії зонда з мембраною. Після чого шукані фрагменти ДНК (РНК) комплементарно зв'язуються зі специфічним зондом, і тоді цей метод називають ДНК-зондової діагностикою. Далі здійснюють детекцию одним з можливих методів (авторадіографіческімі, ферментативно-гібридизаційним і т. Д.).

Метод «сендвіч» - гібридизації. Метод є одним із різновидів зондовой технології (DNA-probe). При його використанні застосовуються два зонда, гомологічні різних ділянках шуканої нуклеїнової кислоти. Один зонд фіксують на мембрані для того, щоб зв'язати шукану нуклеїнових кислот, присутню в досліджуваному зразку. Після здійснення гібридизації мембрану відмивають від досліджуваного матеріалу і додають розчин, що містить другий зонд, який має певну мітку. Процес гібридизації проводять повторно, і при цьому зонд з міткою взаємодіє з шуканим ділянкою ДНК (РНК).

Методи блот-гібридизації. Ідентифікація конкретних фрагментів в гелі серед геномної ДНК є більш складним завданням. Через великих розмірів генома людини після рестрикції утворюється настільки велике число рестріктних фрагментів, що агарозній гель після електрофорезу і забарвлення етидія бромидом при ультрафіолетовому опроміненні виглядає як більш-менш рівномірно пофарбована поверхня. Завдання генетика - виявити специфічні фрагменти ДНК.

ДНК, розділену гель-електрофорезом, можна перенести з гелю на нітроцелюлозний фільтр. Для цього її денатурируют в гелі лугом, нейтралізують гель, і потім прикладають до нього нітроцелюлозний фільтр, забезпечуючи повільний ток буфера через гель і фільтр. Денатурована ДНК дифундує і затримується на фільтрі, після нагрівання, якого у вакуумі вона «запікається» і мобілізують, т. Е. Обездвіжівается на фільтрі. Її розподіл на площині фільтра точно таке ж, як і на площині гелю. Однак на відміну від гелю фільтр з ДНК можна використовувати для подальшої гібридизації з міченої пробою, т. Е. З міченими ДНК і РНК. Для цього инкубируют фільтр з розчином, що містить мічену пробу, при підвищеній температурі, потім ретельно відмивають його і, нарешті, піддають авторадиографии, т. Е. Витримують з рентгенівською фотоплівкою. При прояві останньої на ній виявляються смуги, відповідні смугах ДНК на фільтрі, сгібрідізовавшімся з радіоактивної пробій.

Процедура перенесення ДНК з гелю на фільтр позначається англійським терміном blotting (промокання). Тому для таких фільтрів з ДНК використовується термін «блот» (blot). На ім'я автора Е. Саузерн ці Блот називаються «Блот Саузерн» (Southern blots).

Замість ДНК можна перенести на фільтри з гелю РНК. Такі фільтри називають Норзерн-фільтрами [гра слів: прізвище Саузерн означає «південний»; фільтри з ДНК по Саузерну - південні Блот; фільтри з РНК жартівливо позначили як північні Блот (Northern); фільтри з белкамі- як західні (Western)].

Щоб проводити гібридизацію з Саузерн- і Норзерн- фільтрами, що містять досить малі кількості індивідуальних ДНК і РНК, були потрібні дуже високомеченние проби. Їх навчилися робити шляхом ензиматичного введення мітки в виділені препарати нуклеїнових кислот. Найбільш поширений метод - це так звана нік-трансляція (nick-translation). ДНК инкубируют з двома ферментами, ДНК-полімераза I і ДНКаза I (остання береться в незначних кількостях разом з високомеченнимі попередниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов). ДНКаза вносить в двухцепочечную ДНК одноцепочечниє розриви. На ці місця сідає ДНК-полімераза і руйнує одну з ланцюгів ДНК, одночасно заново її забудовуючи, але використовуючи при цьому мічені попередники. Таким чином, більша частина ДНК заміщається радіоактивної, зберігаючи при цьому свою нуклеотидную послідовність. Є й інші методи включення мітки в ДНК і РНК.

Розглянемо блот-гібридизацію по Саузерну (1975). Ця методика складається з декількох етапів етапів (ріс.49).

Після закінчення електрофорезу гель поміщають в розчин підстави (луги), в якому дволанцюжкові фрагменти ДНК втрачають зв'язку і стають одноланцюжковий.

Перенесення ДНК з гелю на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр проводиться в буферному розчині. Безпосередньо на поверхню гелю кладуть фільтр і стопку фільтрувального паперу. Через капілярного ефекту створюється струм буфера, перпендикулярний площині гелю. Вимивається з гелю ДНК затримується фільтром і практично повністю виявляється на його поверхні. Після перенесення одноцепочечниє нитки фіксують на фільтрі. Розташування фрагментів на фільтрі точно відповідає їх розташуванню в гелі.

Для того щоб візуально виявити потрібні фрагменти (фіксована на фільтрі ДНК не видно), проводять гібридизацію зі специфічним по нуклеотидної послідовності міченим радіонуклідом або флюоресцентной

Ріс.49. Блот-гібридизація по Саузерну

міткою олігонуклеотидних синтетичним зондом (16-30 пар нуклеотидів) або клонованою фрагментом ДНК. Нуклеотидная послідовність зонда повинна бути повністю або частково комплементарна досліджуваному ділянці геномної ДНК.

При інкубації фільтра з розчином, що містить мічений зонд, відбувається гібридизація комплементарних ланцюгів ДНК-зонда і фрагмента на фільтрі. Неспецифически пов'язані молекули зонда відмиваються за допомогою спеціальної процедури. Радіоактивно мічені ділянки виявляють шляхом експонування фільтра з рентгенівською плівкою (авторадіографія). Після прояви на плівці видно смуги меченной зондом ДНК. Нерадіоактивні мітки візуалізують за допомогою флюоресценції або опосередковано з допомогою антитіл. Блот-гібірідізація - високочутливий, але дорогий і трудомісткий метод виявлення специфічних послідовностей ДНК.

Метод норзерн-блот-гібридизації - Northern-blot. Метод використовується для визначення рівня експресії гена шляхом кількісної оцінки іРНК. Метод складний і тривалий по виконанню (5-7 діб). Труднощі пов'язані з необхідністю блокувати при виділенні РНК так звані РНКази, які надзвичайно стабільні і стійкі по відношенню до багатьох хімічних процедур, що застосовуються при екстракції РНК. Процедури блот-гібридизації за Е. Саузерну і Нозерн-блот-гібридизації не знайшли застосування в клінічній мікробіології, оскільки вони трудомісткі. Точками програми даних методів з'явилися завдання, пов'язані з проведенням наукових досліджень і завдань з вивчення геномної структури ДНК (РНК), а також для виявлення точкових мутацій.

Метод гібридизації in situ (ISH - in situ hybridization). Метод заснований на проведенні процесів гібридизації безпосередньо на зрізі або в мазку з використанням будь-яких зондів. Приватна методика гібридизації in situ - FISH (fluorescent in situ hybridization), дозволяє встановити наявність патогена в препаратах, фіксованих у формаліні, і залитих парафіном зрізах і пунктатах тканини, що особливо важливо при патоморфологическом аналізі. Метод гібридизації in situ базується на основних принципах гібридизації твердофазной і гібридизації в розчині. Чутливість методу гібридизації in situ обмежена можливістю проникнення зондів всередину клітин для зв'язування з шуканої мішенню. Процес гібридизації проходить в тканинах, при цьому зонд забезпечений флуоресцентною міткою. Після промивання матеріалу і видалення незв'язаних молекул здійснюється детекція, для чого мазок або зріз переглядають в флуоресцентного мікроскопі. Метод ISH складний для здійснення і в порівнянні з іншими молекулярними методами малочувствителен. Метод найбільш зручний для визначення мішеней, наприклад, вірусів в інфікованих клітинах, які представлені великим числом копій.

Метод розгалуженої ДНК (branch-DNA). Шукана нуклеїнова кислота зв'язується з уловлює зондом, один кінець якої комплементарний мішені, а інший - певного кінця підсилює зонда. При цьому підсилює зонд може бути комплементарен наступного зонду і т. Д. Кількість зондів може бути велике, і всі вони пов'язані з декількома (від одного до декількох десятків) люминофорами, які в міру збільшення кількості пов'язаних зондів підсилюють (Хемі, флуоро-) люмінесценцію. Перевагою даного методу є можливість використання в одній реакції декількох уловлюють і зв'язуються з мішенню зондів, що забезпечує виявлення агентів, що характеризуються значною геномної гетерогенність, наприклад, вірус імунодефіциту людини.

Останнім часом в практиці знайшов застосування метод гібридизації в розчині з зондами, міченими акридином. Результати гібридизації реєструють по випускання міткою світла певної довжини хвилі після обробки лугом.

В даний час ведуться інтенсивні розробки по вдосконаленню методів гібридизації в наступних напрямках:

· Спрощення процедури генного зондування до однієї - двох стадій процесу.

· Відмова від сорбції на мембрані.

· Підвищення чутливості гібрідізаціонних методів за рахунок використання процедури ампліфікації сигналу з зонда.

Активні розробки по третьому напрямку стали можливими лише з моменту появи і впровадження в практику методів ампліфікації нуклеїнових кислот.

Клонування фрагментів нуклеїнових кислот in vitro. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). У більшості випадків для успішної діагностики хвороби або гетерозиготного стану досить досліджувати лише невеликий фрагмент генома, тому для проведення аналізу необхідно отримати достатню кількість таких фрагментів, т. Е. Ампліфікувати (помножити) їх. Раніше ця задача вирішувалася за допомогою трудомісткого підходу: створення рекомбінантних плазміди - введення плазміди в бактеріальну клітину - розмноження бактеріальних клітин - виділення заданих фрагментів ДНК. Тепер це завдання - накопичення потрібних фрагментів ДНК - вирішується за допомогою ПЛР. Відкриття даної реакції вчинила справжню революцію у вивченні геному людини і в молекулярно-генетичної діагностики спадкових хвороб.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - Метод ампліфікації ДНК in vitro. Протягом декількох годин можна розмножити певну послідовність ДНК в кількості, що перевищує вихідне в мільйон разів і більше. Отже, від початку потрібно дуже незначна кількість матеріалу. Необхідною умовою для проведення ПЛР є знання нуклеотидноїпослідовності амплифицируемого фрагмента або, принаймні, цього фрагмента (ріс.50).

Відповідно до нуклеотидної послідовністю решт досліджуваної ділянки синтезується два олігонуклеотидних праймера (затравки). Довжина праймерів становить 20-30 пар нуклеотидів.

Процес ампліфікації полягає в здійсненні повторюваних циклів. Кожен цикл включає 3 стадії: температурна денатурація ДНК (поділ двухцепочечной ДНК на одноцепочечниє молекули) - приєднання праймерів до комплементарних послідовностей одноланцюгових молекул (отжиг) - синтез полінуклеотидних ланцюгів на одноланцюгових молекулах в межах приєднаних праймерів за допомогою полімерази.

Вперше склад інгредієнтів, що входять в реакційну суміш для постановки полімеразної ланцюгової реакції, і основні принципи використання праймерів для отримання копій ДНК були описані Kleppe з співавт. в 1971 році. Однак тоді ще не була продемонстрована основна риса ПЛР - експоненціальне збільшення кількості копій фрагмента вихідної ДНК як результат реакції. Це було здійснено в 1985 р Подальше використання в ПЛР термостабільної ДНК-полімерази істотно розширило можливості її застосування, як в наукових цілях, так і в клініці. Метод став настільки популярний, що сьогодні вже важко уявити роботу в галузі молекулярної біології без його використання. Особливо бурхливий розвиток метод полімеразної ланцюгової реакції отримав завдяки міжнародній програмі «Геном людини». Були створені сучасні лазерні технології сіквенірованія (розшифровки нуклеотидних послідовностей ДНК). Якщо в недавньому минулому для розшифровки послідовності ДНК розміром в 250 пар нуклеотидів (п. Н.) Була потрібна тиждень, то сучасні лазерні секвенатори дозволяють визначати

Ріс.50. Три етапи ПЛР-аналізу

до 5000 п. н. в день. Це в свою чергу сприяє значному зростанню інформаційних баз даних, що містять послідовності ДНК. В даний час запропоновані різноманітні модифікації ПЛР, показана можливість створення тест-систем для виявлення мікроорганізмів, виявлення точкових мутацій, описані десятки різних застосувань методу. В даний час ПЛР використовується при діагностиці: генетичних, інфекційних і онкологічних захворювань; патогенів в їжі; ідентифікації особистості; в судовій медицині, криміналістиці; при трансплантації органів і тканин; визначенні батьківства. На відміну від імуноферментного аналізу, який широко використовується для діагностики інфекційних захворювань, ДНК-діагностика дозволяє визначати безпосередньо збудника захворювання. За допомогою вдосконалених схем постановки ПЛР можна виявляти патогенні мікроорганізми в дуже низькій концентрації.

ДНК-діагностика раку обмежується невеликим, але активно зростаючою кількістю відомостей про генах, асоційованих з раком. В рамках проекту «Геном людини» вчені продовжують пошуки мутацій, асоційованих з цим типом захворювань.

Полімеразна ланцюгова реакція - це здійснювана in vitro специфічна ампліфікація нуклеїнових кислот, що ініціюється синтетичними олігонуклеотидних праймерами; її основні етапи представлені на рис. ПЛР-цикл складається з теплової денатурації ДНК, її відпалу з праймером і подовження ланцюга (елонгації); зміна цих етапів відбувається в результаті простого зміни температури. Праймери при цьому орієнтуються на матриці так, що число раундів реплікації росте експоненціально, відповідно збільшується і число копій специфічної нуклеотидної послідовності.

Застосування молекулярних методів для цілей клінічної діагностики обмежується їхньою невисокою чутливістю і тривалістю аналізу. Так, для виявлення нуклеїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ з присутня в препараті в декількох тисячах копій. Нерідко число аномальних послідовностей в клінічному препараті діагностіческі- значимо, але менше цієї величини і гібридизація може дати помилково негативний результат. На відміну від цього ПЛР дозволяє виявити унікальну нуклеотидну послідовність. Для цього в реакційну суміш додають у великому надлишку специфічні для даної послідовності олігонуклеотидних праймери ( «амплімери»), які утворюють з нею комплекс, і проводять реплікацію ДНК in vitro. Оскільки амплімери гибрідизуючою з обома ланцюгами ДНК, то і нативная послідовність, і синтезовані ПЛР-продукти можуть служити матрицями в наступних раундах реплікації, в результаті чого число копій унікальної послідовності експоненціально збільшується. Завдяки цьому послідовності, присутні в клінічному препараті в мінімальній кількості (одна або кілька копій) і не виявляються ніякими іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. ПЛР дозволяє знайти всього одну аномальну послідовність на 100000-1000000 нормальних клітин.

Експоненціальне збільшення числа копій молекули-мішені не тільки забезпечує високу чутливість методу, але і полегшує їх виявлення. Кожен раунд ПЛР займає від 2 до 5 хв, і зазвичай для досягнення необхідної чутливості досить 25-50 раундів, т. Е. 2-4 ч (ріс.51). Крім того, оскільки зміст ПЛР-продуктів досить велике, можна використовувати неізотопних методи детекції.

Ампліфікація РНК. Можливість використання РНК в якості мішені для ПЛР істотно розширює спектр застосування цього методу. Наприклад, геноми багатьох вірусів (гепатиту С, вірус інфлюенци, пікорнавіруси і т. Д.) Представлені саме РНК. При цьому в їх життєвих циклах відсутня проміжна фаза перетворення в ДНК. Для детекції РНК необхідно в першу чергу перевести її в форму ДНК. Для цього використовують зворотну транскриптазу, яку виділяють з двох різних вірусів: avian myeloblastosis virus і Moloney murine leukemia virus. Використання цих ферментів пов'язане з деякими труднощами. Перш за все, вони термолабільни і тому можуть бути використані при температурі не вище 42 ° С. Так як при такій

Ріс.51. Полімеразна ланцюгова реакція

температурі молекули РНК легко утворюють вторинні структури, то ефективність реакції помітно знижується і за різними оцінками приблизно дорівнює 5%. Робляться спроби обійти цей недолік використовуючи в якості зворотної транскриптази термостабільну полимеразу, отриману з термофільного мікроорганізму Thermus thermophilus, який виявляє транскріптазная активність в присутності Mn2+. Це єдиний відомий фермент, здатний виявляти як полимеразную, так і транскріптазная активність.

Для проведення реакції зворотної транскрипції в реакційній суміші також як і в ПЛР повинні бути присутніми праймери в якості затравки і суміш 4-х дНТФ, як будівельний матеріал.

Після проведення реакції зворотної транскрипції, отримані молекули кДНК можуть служити мішенню для проведення ПЛР.

Підбір праймерів. ПЛР-праймери, або амплімери, зазвичай мають розмір від 18 до 25 нуклеотидів. Їх можна синтезувати за допомогою автоматичних синтезаторів ДНК, наявних в більшості великих дослідних центрів. Кількості одержуваних таким чином олігонуклеотидів (0,2-1 мкмоль) зазвичай досить для проведення декількох сотень або тисяч ПЛР-реакцій. Часто в 5'-кінцева ділянка праймерів для спрощення клонування ПЛР-ампліфікованої ДНК вводять сайти впізнавання для рестріктірующіх ендонуклеаз.

Підбір праймерів - ключова ланка ПЛР, оскільки саме ними визначається можливість ампліфікації і виявлення потрібної послідовності, а також надзвичайна гнучкість методу. Просте варіювання праймерів дозволяє виявляти багато патогенні мікроорганізми і генетичні порушення при мінімальних змінах в методиці.

ПЛР-ампліфіковані фрагменти ДНК мають різний розмір. Він визначається сумою розміру праймерів і відстані між їх 3'-кінцями і в більшості випадків лежить в діапазоні 100-300 нуклеотидів. Можлива ампліфікація (але зазвичай менш успішна) послідовностей-мішеней довжиною понад 1000 п. Н. Швидкість реплікації за допомогою ДНК-полімерази Tag становить 35-100 нуклеотидів в секунду.

Таg-полімераза. У 1980 році полімеразна активність була відкрита у деяких форм термофільних бактерій. Таg-полімераза була виділена з бактерій виду Thermus aquaticus, здатних рости при температурі 70-75 ° С. Молекулярний вага очищеного протеїну 94 кД і оптимальна температура полімеразної активності 70-80 ° С. Активність ферменту зменшується, але полімераза НЕ денатурируется при 90 ° С, при зниженні температури до 70-80 ° С рівень активності відновлюється.

Tag-полімераза має дуже високу швидкість синтезу. За оптимальних умов фермент може добудовувати до 150 основ на секунду. При низькій температурі активність падає до 2 основ на секунду. Час напіввиведення Таg-полімерази при 95 ° С становить 40 хвилин.

секвенування ДНК- Визначення нуклеотидної послідовності. В даний час розроблені методи визначення повної нуклеотидної послідовності будь-молекули ДНК. При вирішенні цього завдання необхідно мати велику кількість ідентичних фрагментів молекул ДНК. Напрацювання цікавлять послідовностей можна здійснити клонуванням відповідного фрагмента, наприклад, методом ПЛР. Метод секвенування по Максама - Гилберту заснований на хімічному розщепленні ДНК за певним основи. Інший ферментативний метод (метод Сенгера) базується на застосуванні аналогів нуклеотидів, що переривають синтез комплементарної ланцюга ДНК за одноцепочечной матриці в місці вбудовування в ланцюг відповідного аналога. Секвенування дозволяє визначити повну нуклеотидну послідовність всіх хромосом, всього ДНК будь-якого генома, будь-якого організму. Це вже майже повністю зроблено для деяких бактерій, мухи дрозофіли, миші і людини. Крім того, цей метод дозволяє визначити послідовність нуклеотидів будь-яких генів, що дає можливість їх синтезу.

Методи ДНК-діагностики.Прямі та непрямі методи ДНК-діагностики. Види ДНК-діагностики: підтверджує, Пресимптоматичне, носійства, пренатальна.

Принципово розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику моногенних спадкових хвороб. Прямі методи можливі лише за умови, що ген захворювання клонований, відома його екзон-інтронна організація або нуклеотидних послідовність повнорозмірною комплементарної ДНК. При прямий діагностиці предметом аналізу є мутації гена. Головною перевагою прямих методів діагностики є майже 100% ефективність.

Однак в більшості випадків спадкових захворювань ген НЕ клонований чи захворювання є генетично гетерогенним, т. Е. Обумовлено ушкодженнями в різних генах, або молекулярна організація гена не дозволяє використовувати прямі методи. Ці труднощі можуть бути подолані за допомогою непрямих методів ДНК-діагностики, заснованих на використанні зчеплених з геном поліморфних маркерів. В цьому випадку визначається гаплотип хромосоми, що несе ген в сім'ях високого ризику, т. Е. У батьків хворого і його найближчих родичів. Такий підхід можливий практично для всіх моногенних захворювань з відомою локалізацією гена.

Прямі методи пошуку мутацій. У ДНК-діагностики в даний час використовуються різноманітні прямі методи. Найбільш просто виявляються мутації, які змінюють довжину ампліфикувати фрагментів ДНК, які виявляються при електрофоретичному аналізі.

Для виявлення точкових мутацій, невеликих делеций і инсерций в досліджуваних генах використовується безліч різних підходів, заснованих на методі ПЛР, завдяки якому можна суттєво збільшити унікальну послідовність ДНК, а потім проаналізувати її на предмет мутації. За допомогою специфічних олігонуклеотидних праймерів проводять ампліфікацію кодують ділянок геномної ДНК в разі, якщо відома екзон-ннтронная структура досліджуваного гена.

Якщо структура гена не відома, то отримують кДНК-продукти шляхом зворотної транскрипції мРНК, виділеної з клітин хворих. Продукти ампліфікації є об'єктами подальшого пошуку мутацій за допомогою ряду методів, що дозволяють виявляти невеликі структурні зміни.

Методи, засновані на технології ПЛР. У загальному випадку секвенування повнорозмірною кДНК, або всіх екзонів, для визначення мутацій у окремих пацієнтів досить трудомістким, дорого і вимагає великих витрат часу. Тому на практиці частіше проводять попередній відбір простішими методами ампліфікації фрагментів ДНК, імовірно містять мутації, а потім секвеніруют тільки ці ділянки ДНК. Методи пошуку фрагментів ДНК, що містять мутації, засновані на порівняльному аналізі мутантних і нормальних послідовностей за цілою низкою фізичних і хімічних характеристик, які в значній мірі варіюють в залежності від типу мутаційного ушкодження. Слід підкреслити, що незалежно від методу детекції мутації точні молекулярні характеристики кожної мутації можуть бути отримані тільки шляхом прямого секвенування.

Найбільш просто виявляються мутації, які змінюють довжину ампліфикувати фрагментів, так як подібні порушення легко виявляються при електрофоретичному аналізі. Протяжні делеції, захоплюючі цілі Екзони в генах, зчеплених зі статтю, можуть успішно виявлятися при використанні так званого мультиплексного варіанти ПЛР. Різниця в розмірах і числі ампліфикувати фрагментів дозволяє легко ідентифікувати такі мутації при електрофорезі. Даний підхід можна застосувати до аналізу делеций в аутосомних генах тільки в тих випадках, коли можливо доповнити ПЛР кількісною оцінкою результатів ампліфікації. Оригінальний метод ідентифікації подібних делеций у гетерозигот заснований на використанні в якості матричної ДНК для ПЛР кДНК, отриманої шляхом зворотної транскрипції мРНК, ізольованої з експрессірующіх даний ген тканин пацієнта. На відміну від нормального гомолога, в мутантної молекулі кДНК Екзони межують з делецией зближені. Для виявлення гетерозигот по протяжним внугрігенним ділок проводять мультиплексную ПЛР з використанням системи олігопраймеров, повністю перекривають всю молекулу кДНК. Наявність делеций реєструють по появі продуктів ампліфікації незвичайного розміру.

Після виявлення відмінностей між нормальною і мутантної ДНК по довжині амплифицированного фрагмента необхідно провести секвенування незвичайного фрагмента з метою визначення змін в нуклеотидної послідовності імовірно мутантної ДНК.

При мутаціях гена, що представляють собою заміну одного або декількох нуклеотидів, довжини ампліфикувати фрагментів залишаються постійними, однак деякі фізико-хімічні властивості мутантних молекул змінюються. З урахуванням цих особливостей розроблені різні варіанти пошуку мутантних фрагментів ДНК та ідентифікації в них точкових мутацій. Провідними з цих методів є: метод аналізу інформаційного поліморфізму однонитевой ДНК (SSCP), метод аналізу гетеродуплексов (НА), денатурує градієнтний гель-електрофорез (DGGE) і метод хімічного розщеплення некомплементарни сайтів (ССМ).

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - Метод аналізу Конформа-ційного поліморфізму однонитевой ДНК - заснований на реєстрації відмінностей в електрофоретичної рухливості однониткових ДНК, однакових за величиною, але розрізняються внаслідок нуклеотидних замін по просторової організації молекул. Конформація невеликих однониткових ДНК залежить від нуклеотидної послідовності, тому заміна навіть одного нуклеотиду призводить до зміни просторової структури. Метод включає ампліфікацію фрагментів ДНК розміром до 300 пар нуклеотидів, денатурацію продуктів ПЛР і високоразрешающем гелевий електрофорез.

Конформаційний метод виявлення точкових мутацій набув широкого поширення внаслідок відносної простоти і можливості виявляти будь-які типи замін. Однак обмеженням застосування цього методу є розмір досліджуваного фрагмента ДНК, так як висока ефективність детекції мутацій, складова 80-95%, показана при довжині фрагментів менше 200 пар нуклеотидів, в той час як для фрагментів більше 400 пар нуклеотидів ймовірність виявлення мутацій зменшується до 50% .

В даний час роздільна здатність методу значно підвищена. Зокрема, розроблено підходи для ідентифікації точкових мутацій методом SSCP-аналізу в ампліфикувати фрагментах ДНК розміром до 800 пар нуклеотидів. Для цього використовується поліакріламідний гель з низьким значенням рН.

НА (Heteroduplex Analysis) дозволяє виявляти мутації, що знаходяться в гетерозиготному стані, а також инсерции і делеції. Принцип цього методу полягає в наступному.

При ампліфікації фрагментів генів гетерозигот, подальшої денатурації та повільної ренатурації отриманих продуктів ПЛР в ампліфікаціонних суміші поряд з двома типами гомодуплексов утворюються гетеродуплекси між нормальною і мутантної ланцюгами ДНК. Такі гетеродуплексние молекули відрізняються по електрофоретичної рухливості від гомодуплексов за рахунок конформаційних особливостей в місцях розбіжності нуклеотидів, оскільки електрофоретична рухливість гетеродуплексов значно нижче, ніж гомодуплексов. Ці відмінності виявляються при електрофорезі в звичайному поліакриламідному гелі.

На сьогоднішній момент найбільш поширеним способом скринінгу мутацій є комбінація аналізу гетеродуплексов і методу однонітевую конформационного поліморфізму, що дозволяє виявити точкове мутації майже у 100% випадків і не вимагає великих витрат часу.

DGGE - Денатурує градієнтний гель-електрофорез. У цьому методі ДНК-дуплекси піддаються міграції в гелі з градієнтом денатуруючих умов (може бути використаний і температурний градієнт). Міграція триває до тих пір, поки ДНК-дуплекси не досягають в гелі точки плавлення і не розділяються, після чого міграція фрагментів зупиняється. Однонуклеотидні відмінності в нормальної і тестується ДНК виявляються по різної електрофоретичної рухливості в гелі. Висока чутливість методу (95%) досягається завдяки специфічним праймерів з так званим GC-затискачем, представленим чергуванням гуаніну і цитозину в кількості до 20 нуклеотидів. За рахунок цього температура плавлення продукту ампліфікації сильно збільшується, що підвищує ефективність визначення мутації. Однак праймери з GC-затискачем досить дороги, тому метод використовується обмежено.

ССМ (chemical cleavage of mismatch) - Метод хімічного розщеплення неспарених підстав. Метод заснований на гібридизації радіоактивно міченої ДНК-проби з тестованої ДНК. Місця помилок потім виявляють за допомогою серії хімічних реакцій (модифікація з використанням тетрахлорида осмію), які відбуваються з однонитевой ДНК в сайтах неправильного спаровування. Цей метод може бути застосований для тестування фрагментів ДНК розміром до 1 тис. Пар нуклеотидів, виявляє локалізацію помилки і є досить чутливим. Однак він не знайшов широкого поширення внаслідок токсичності застосовуваних хімічних реагентів і методичної складності. Подібне розщеплення неспарених нуклеотидів може бути і ензиматичними, що дозволяє уникнути токсичних хімікатів. Метод заснований на розщепленні неспарених підстав в гетеро-дуплексі, утвореному між тестованої ДНК і нормальної послідовністю за допомогою таких ферментів, як резолваза фага Т4 або ендонуклеаза VII. Однак цей метод ще більш «примхливий», ніж ССМ.

Заключним етапом аналізу мутацій є їх секвенування, т. Е. Визначення нуклеотидної послідовності фрагмента ДНК, який показав аномальну електрофоретична рухливість. Послідовність нуклеотидів цього фрагмента порівнюється з нормою, в результаті чого патологія набуває свою остаточну характеристику.

метод секвенування. Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого секвенування мутантної кДНК або окремих екзонів, і часто первинний пошук порушень в кодують областях гена здійснюють саме таким чином. Для деяких генів, що мають невеликі розміри, метод прямого секвенування з успіхом застосовується як основний метод сканування мутацій. Так, зокрема, особливо зручним виявилося його застосування для детекції мутацій в порівняно невеликих за розміром генах, таких, як ген фактора IX згортання крові (гемофілія В).

Розроблені в останні роки модифікації методів ПЛР значно полегшили секвенування ампліфикувати фрагментів і підвищили його ефективність. Так, зокрема, запропонований варіант асиметричної ПЛР, коли при ампліфікації концентрація одного з олігопраймеров в кілька десятків разів перевищує концентрацію іншого праймера, в результаті чого синтезується переважно тільки одна, потрібна для секвенування ланцюжок ДНК.

Лікар лаборант-генетик заздалегідь визначає стратегію пошуку виходячи з оснащеності лабораторії.

Багато мутації переривають синтез білкового продукту. У цих випадках утворюються укорочені поліпептидні ланцюги, функціонально незначущі. Для діагностики таких мутацій можна застосовувати метод «трансляції білкового продукту». Він проводиться в системі in vitro на основі отриманої специфічної мРНК з додаванням лизата ретикулоцитів (в ньому містяться всі необхідні компоненти для синтезу білка). У цій системі синтезується білковий продукт відповідного гена. Продукт трансляції аналізують за допомогою електрофорезу. Зміна електрофоретичної рухливості білка свідчить про наявність мутації (нонсенс-мутація, порушення сплайсингу РНК, зрушення рамки зчитування), що приводить до «обриву» синтезу поліпептидного ланцюжка.

Непряме виявлення мутацій. Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли нуклеотидная послідовність гена ще не відома і в той же час є інформація про відносне положення гена на генетичній карті. Фактично це відповідає діагностиці за допомогою методу зчеплення генів.

Непряма ДНК-діагностика по суті зводиться до аналізу поліморфних генетичних маркерів у хворих і здорових членів сім'ї. Маркери повинні бути розташовані в тому хромосомному регіоні, де і ген хвороби, т. Е. Вони зчеплені. Такими маркерами можуть бути ділянки ДНК, що існують в популяції в декількох алельних варіантах. Відмінності можуть бути за складом нуклеотидів, по числу дінуклеотідних повторів. На основі варіабельності складу маркерних ділянок ДНК можна диференціювати материнське або батьківське походження конкретного варіанту маркера, зчепленого з геном хвороби. Зчеплення означає, що маркер і ген хвороби розташовуються близько один від одного; вони передаються в складі одного хромосомного сегменту. Завдяки аналізу поліморфних генетичних маркерів можна простежити в ряду поколінь успадкування кожної з батьківських хромосом.

Технічні прийоми в непрямій діагностиці ті ж самі, що і в прямій діагностиці (отримання ДНК, рестрикция, електрофорез і т. Д.). Природно, до цього додається математичний аналіз зчеплення ознак.

Використання непрямих підходів виявилося можливим завдяки існуванню в геномі поліморфних ділянок (локусів) ДНК. Нуклеотидні заміни досить часто зустрічаються в некодуючих ділянках ДНК. Значне число нуклеотидних замін призводить до зміни місць рестрикції. Ці зміни можна виявити за допомогою блот-гібридизації за Саузерну, оскільки змінюється довжина рестріктних фрагментів. Цей різновид поліморфізму ДНК отримала назву поліморфізму по довжині рестріктних фрагментів.

Розташований поблизу досліджуваного гена або всередині нього поліморфний сайт може служити маркером алельних варіантів цього гена, в тому числі маркером патологічних мутацій.

Поліморфізм, обумовлений нуклеотидними замінами або делеціями, як правило, діаллелен, а значить, його інформаційна цінність обмежена. Більш інформативними є кластери тандемних повторів, які обумовлюють поліморфізм за кількістю копій (VNTR - variable number of tandem repeates), так званий поліморфізм міні- і мікросателітних послідовностей.

Мікросателіти - короткі тандемні повтори, зазвичай дво-гексануклеотідние. Найпоширенішим з них є СА-повтор. Показано, що кластери СА-повторів зустрічаються в середньому 1 на 30 тис. Пар нуклеотидів. Вони локалізовані, як правило, в некодуючих районах ДНК. Блоки СА-повторів демонструють спадкоємство Менделя в сім'ях і не виявляють нових мутацій. Важливим позитивним фактором є відносна простота виявлення таких повторів в геномі людини. Крім СА-повторів, досить поширені GA-повтори та інші кластери тандемних повторів (ТТТА) П; (ТСТА) П; (ТТТС) П, також виявляють варіабельність по числу повторів. Широка поширеність в геномі (частота різних мікросателітів, взятих разом, становить 1 на 6 тис. Пар нуклеотидів), високий рівень поліморфізму роблять мікро- і мінісателіти ідеальними поліморфними маркерами для картування генів спадкових захворювань і проведення непрямої ДНК-діагностики.

Поліморфні ДНК-маркери і інтегральна карта їх розташування дозволяють визначити і простежити в поколіннях хромосому, яка несе патологічний ген, а також докладно охарактеризувати певний хромосомний район, виявити субмикроскопические перебудови, визначити найменший район їх перекривання і локалізувати ген-кандидат, відповідальний за захворювання.

Основний недолік непрямих методів діагностики - обов'язкове попереднє вивчення генотипу (гаплотипу) хоча б одного ураженого родича. У разі відсутності уражених родичів, «доступних» для обстеження, проведення діагностики (за рідкісним винятком) стає неможливим.

Отже, навіть з схематичного опису неважко зрозуміти, що існує досить багато молекулярно-генетичних методів діагностики спадкових хвороб. Ці методи виявилися настільки універсальними, що знайшли застосування не тільки в медичній генетиці, але і в діагностиці інфекційних захворювань. Для кожного з методів є багато варіантів. Одні і ті ж хвороби можна діагностувати різними методами. Звідси неважко зробити висновок, що є великі можливості для діагностики хвороби навіть у важких випадках (неможливість обстеження батьків, мала кількість біологічного матеріалу, відсутність відомостей про гені і т. Д.).

Автоматизація існуючих і розробка принципово нових підходів до вивчення структури нуклеїнових кислот поряд з прискореними темпами вивчення генома людини і клонування генів, відповідальних за розвиток моногенной патології, дозволяють прогнозувати появу в недалекому майбутньому засобів діагностики більшості відомих спадкових хвороб людини.

Мікрочіпи. ДНК-мікрочіпи дозволяють здійснювати автоматизований і високопродуктивний аналіз складних геномів. Ця технологія в її різних варіантах розвивається дуже інтенсивно. Коротко розглянемо принципи технології та її застосування до медичних проблем. Найпростіший принцип мікрочіпа: в різні квадрати твердої підкладки поміщаються олігонуклеотиди, що відповідають різним аллелям одного гена. Наприклад, представлено 3 алельних олигонуклеотида, що розрізняються однією заміною, які ковалентно прикріплені до підкладки. Ці олігонуклеотиди відповідають трьом варіантам мононуклеотідного поліморфізму (SNP, single nucleotide polymorphism). Таким чином, кожному аллелю відведений на підкладці свій квадрат. Задамося питанням, який аллель або які алелі даного локусу представлені в ДНК пацієнта. Це питання вирішується за допомогою гібридизації меченной радіоактивно або флюоресцентної проби ДНК від пацієнта з мікрочіпом. Якщо в цій пробі представлений, наприклад, тільки аллель 1, то гібридизація відбуватиметься тільки з тим квадратом, де иммобилизован олигонуклеотид 1. Якщо в пробі представлені 2 алелі (1 і 2), то гібридизація відбуватиметься з двома квадратами (1 і 2) і т. д. мікрочіпи, що містять пов'язані з підкладкою олігонуклеотиди, будемо далі визначати як олігонуклеотидних мікрочіпи. ДНК-олігонуклеотидний чіп, що містить тисячі олігонуклеотидів, створюється сучасними методами протягом 1 дня. Може бути приготовлена ??серія мікрочіпів, що містить сотні тисяч олігонуклеотидів із заданою послідовністю. Як і в наведеному вище схематичному прикладі, техніка аналізу заснована на фізичній гібридизації досліджуваної ДНК з безліччю олігонуклеотидів, іммобілізованих на твердій основі. Такий підхід передбачає відоме знання структур алелей. Його визначають як «придбання проби» (gain of probe). Негайним застосуванням такого підходу може стати аналіз зчеплень. Якщо в сім'ї з хворобою зчеплений один з алелів маркера, тоді як інший аллель (аллели) зчеплений зі здоровим геном, то аналіз зчеплень може бути виконаний таким чином:

· Амплифицируют у кожного члена сім'ї поліморфний аллель за допомогою праймерів Р1 і Р2,

· Позначте ампліфіковані продукти за допомогою радіоактивної або флюоресцентной мітки,

· Гібридизується кожен продукт з мікрочіпом і виявите квадрат, в якому відбулося зв'язування з міченої пробою. Цей квадрат буде показувати, який аллель присутній у даного члена сім'ї.

Технологія може бути використана для аналізу поліморфізму геному. Зокрема, 149 мікрочіпів, кожен з яких містив 150 000- 300 000 олігонуклеотидів, були використані для скринінгу 263 млн п. О. послідовності генома людини, і в результаті був виявлений 3241 поліморфний сайт. Слід звернути увагу на те, що у всіх випадках досліджувалася певна, невелика в порівнянні з повним геномом, область.

Незважаючи на вражаючі результати і уявну простоту описаної вище технології, що використовує олігонуклеотидних мікрочіпи, існує безліч проблем, пов'язаних з її практичним використанням. Мікрочіпи можуть давати високий рівень хибнопозитивних відповідей при виявленні SNP. Інсерції, вставки, делеції і перегрупування важко піддаються аналізу цим методом. Повторювані елементи генома також здатні вносити серйозні ускладнення в аналіз.

Крім детекції мутацій і поліморфізмів, олігонуклеотидних мікрочіпи припускають використовувати для створення генетичної карти третього покоління. Зокрема, олігонуклеотиди, відповідні SNP, легко можна помістити на мікрочіпи. Оскільки SNP в основному діаллельни, для створення карти їх потрібно в 3 рази більше, ніж мультіаллельних маркерів. Можна передбачити безліч інших застосувань олігонуклеотидних мікрочіпів, включаючи аналіз зчеплень і асоціацій, втрату гетерозиготності і ДНК-дактилоскопію.

Інший важливий аспект використання олігонуклеотидних мікрочіпів - аналіз експресії генів. Аналіз особливостей експресії генів - один з необхідних елементів для розуміння їх функцій. 20-ланки олигонуклеотид, що представляє певний ген, очевидно, достатній для надійного виявлення продукту цього гена серед клітинних РНК. Зміст транскриптов може бути виміряна аж до декількох копій на клітину. Вдається простежувати експресію 10 000 генів на 1 чіп. Ця система вже використана для вивчення змін в експресії генів в ракових клітинах. Порівняння експресії 900 генів в 2 клітинних лініях показало, що при пухлинної трансформації 1,7% генів знижувало рівень експресії, тоді як 7% - підвищувало.

Для аналізу експресії генів використовують також інший варіант мікрочіпів, що містять не олігонуклеотиди. а іммобілізовані кДНК. В випадків кДНК-мікрочіпів ППР-ампліфіковані фрагменти індивідуальних кДНК наносять в різні квадрати мікрочіпа, так що кожен квадрат ставиться у відповідність з певним геном. ДНК фіксують в цих квадратах і денатурируют, щоб зробити її одноцепочечной. Чіп з иммобилизованной ДНК гибрідизуючою з сумішшю різному флюоресцентної мічених кДНК, отриманих з порівнюваних тканин, точно так же, як це робилося в разі олігонуклеотидних мікрочіпів.

Нещодавно кДНК-мікрочіпи використовували також для аналізу відмінностей близькоспоріднених геномів. В цьому випадку технологія була використана для аналізу ДНК із клітинних ліній і пухлин з відомими хромосомними аномаліями, щоб оцінити перспективність методу. Показана можливість виявлення делеції в одній з хромосом і відмінності в числі копій хромосом в анеуплоїдних клітинах.

Хоча вихідної ідеєю використання мікрочіпів було швидке секвенування ДНК, зараз ця ідея відійшла на задній план. Однак чіпи можуть бути використані для повторного секвенування вже відомих послідовностей. Зокрема, був ресеквенірован повний мітохондріапьний геном довжиною 16,6 кілобаз, мітохондріальний чіп містив 136


Контроль на рівні трансляції та посттрансляційних процесів. | Організація геномів неклітинних і клітинних організмів | ДНК-геноми | геном бактерій | Особливості плазмід. | Організація геному еукаріот. | Молекулярні механізми генних, хромосомних і геномних мутацій | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 1 сторінка | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 2 сторінка | Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетики. 3 сторінка |

загрузка...
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати