загрузка...
загрузка...
На головну

Молекулярні механізми генних, хромосомних і геномних мутацій

  1. III Механізми психологічного вампіризму і типи психологічних вампірів
  2. IV етап (з середини XX ст. По теперішній час) - психологія як наука, що вивчає факти, закономірності та механізми психіки
  3. IV. Механізми державного управління
  4. IV. Механізми державного управління
  5. IV. Механізми державного управління
  6. IV. Механізми державного управління
  7. IV. Механізми державного управління

Мутационная мінливість у людини. Молекулярні механізми генних мутацій. Класифікація генних мутацій. Поняття про моногенні спадкові захворювання. Молекулярні і цитологічні механізми хромосомних мутацій. Сучасні методи вивчення каріотипу людини: диференційоване фарбування, FISH-метод та ін. Класифікація мутацій за причинами виникнення. Мутагенні фактори, методи визначення мутагенної активності речовин. Антімутагенез. Генеративні і соматичні мутації.

Мутационная мінливість у людини. Стабільність генетичного апарату і обумовлюється цим апаратом консерватизм спадковості - лише одна сторона спадковості. Інша її сторона, так само невід'ємна від живого, як і перша, - мінливість. У сукупності спадковість і мінливість забезпечили і збереження життя на Землі, і безперервну біологічну еволюцію. Спадкова мінливість організму забезпечує необхідну йому пристосовність до умов існування як в межах життя одного індивіда, так і в рамках існування біологічного виду в цілому. Спадкове різноманіття людини - результат тривалої еволюції живої матерії. При цьому треба мати на увазі особливості еволюції людини як біологічної та соціальної істоти. У людини як соціальної істоти природний відбір з часом протікав все в більш специфічних формах, що, безумовно, розширювало спадкове різноманітність популяцій. Зберігалася то, що могло «відмітатися» у тварин, або, навпаки, втрачалося те, що потрібно тваринам. Наприклад, більш повноцінне забезпечення себе їжею і можливість задовольняти потребу у вітаміні С дозволили людині в процесі еволюції «загубити» ген L-гулонолактоноксідази, що каталізує у тварин синтез аскорбінової кислоти. Наявність цього гена у тварин страхує їх від розвитку цинги, а людина через таку «загальної вродженої помилки метаболізму» схильний авітамінозу С. В процесі еволюції людина «набував» і небажані ознаки, які мають пряме відношення до патології людини. Більшість видів тварин несприйнятливо до дифтерійного токсину і вірусу поліомієліту, тому що у тварин відсутні компоненти мембрани клітин, що забезпечують сприйняття того чи іншого патогенного фактора. У людини ці компоненти є. Гени, їх детермінують, уже ідентифіковані. Наприклад, для сприйняття дифтерійного токсину такий ген локалізований в 5-й, для вірусу поліомієліту - в 19-й хромосомі.

Більшість мутацій збільшує поліморфізм людських популяцій (групи крові, колір волосся, зріст, розріз очей і ін.), Але іноді мутації зачіпають життєво важливі функції, а це вже призводить до хвороби. Таким чином, спадкова патологія - частина спадкової мінливості, що накопичилася за час еволюції людини. Людина, ставши біологічним видом Homo sapiens (людина розумна), як би заплатив за «сапіентаціі» свого виду накопиченням патологічних мутацій. На основі цих положень формулюється одна з головних концепцій медичної генетики про еволюційний накопиченні патологічних мутацій в людських популяціях. Підтвердженням цієї концепції є патологічні мутації у тварин, за своїми проявами схожі зі спадковими хворобами у людини (ахондроплазії. Гемофілії, м'язова дистрофія та ін.), А також наявність спадкових хвороб у людей, що жили кілька тисячоліть тому (про що можна судити по знахідках патологічних скелетів в розкопках і творам мистецтва).

Еволюція будь-якого виду, в тому числі і людини, в кінцевому рахунку, зводиться до еволюції генотипу. У біологічної еволюції людини хвороба як фактор природного добору могла відігравати суттєву роль, а еволюція генотипу в свою чергу змінювала нозологію патологічних процесів. Залежність еволюції хвороби від еволюції генотипу навряд чи може викликати сумнів. Вище були наведені конкретні форми цієї залежності (цинга, дифтерія, поліомієліт). Фактори еволюції протягом тривалого часу впливали не тільки на формування біохімічних, імунологічних, фізіологічних або морфологічних властивостей організму, але і на його патологічні реакції, обумовлюючи значно більше різноманіття нозологічних форм хвороб у людини в порівнянні з такими у тварин.

Основним джерелом різноманіття спадкових ознак і їх безперервної еволюції служить мутационная мінливість. Здатність ДНК мутувати склалася в еволюції і закріпилася відбором, мабуть, так само, як і здатність протистояти мутаційним змін, т. Е. Репарирувати їх. В організації ДНК закладена можливість помилок її реплікації поряд з можливістю зміни первинної структури. Імовірність «збою» в точності реплікації молекули ДНК невелика: вона становить 10-5-10-7. Однак, беручи до уваги виключно велике число нуклеотидів в геномі (3,2 х 109 на гаплоїдний набір), слід визнати, що в сумі на геном клітини на одне її покоління доводиться кілька мутацій в структурних генах. На думку різних авторів, кожен індивід успадковує 2-3 нові шкідливі мутації, які можуть давати летальний ефект або підхоплюватися відбором, збільшуючи генетичну різноманітність людських популяцій.

Зміна нуклеотидноїпослідовності молекули ДНК може відбитися на первинній (амінокислотної) структурі білка або на регуляції його синтезу. Так, великий досвід вивчення молекулярної природи мутацій гемоглобіну показує, що значна частина таких мутацій не змінює функції гемоглобіну. Такі мутації нейтральні і не піддаються відбору. Інші мутації призводять до функціональних відхилень в молекулі білка. Ці відхилення в якихось умовах життя організму можуть виявитися корисними, т. Е. Мати адаптивне значення, тому збережуться, а іноді і примножиться в наступних поколіннях. Саме таким шляхом виникали і зберігалися в популяціях різноманітні варіанти структурних, транспортних і ферментних білків організму. Властивий організму людини широкий білковий поліморфізм, завдяки якому кожен індивід біохімічно неповторний, обумовлений початково мутаційної мінливістю і відбором адаптивних білкових варіантів.

Однак, якщо структурні відхилення несумісні з виконанням білком його функції, а вона життєво важлива для клітини (організму), мутація стає патологічною і надалі або виключається з популяції разом з нежиттєздатною кліткою (організмом), або зберігається, обумовлюючи спадкову хворобу. В окремих випадках гетерозиготні носії патологічної мутації піддаються позитивному відбору. Прикладом цього служить ген серповидно-клітинної анемії, який широко розповсюдився в популяціях, які проживають в ендемічних з малярії районах, внаслідок великої стійкості гетерозиготних носіїв «аномального» гена (мутантного аллеля) до малярийному плазмодию.

Різні ознаки організму по-різному стійкі до мутаційні змін, що пов'язано, мабуть, із значенням ознаки і з його еволюційним «віком». Такі ознаки, як гістонові білки, що входять до складу хромосом, або скоротливі білки актин і тубулін, або ферментні білки реплікації і транскрипції, досить консервативні і однакові не тільки у різних представників людства, а й у біологічних видів значною філогенетичної віддаленості. Мабуть, мутації в відповідних генах детальні. Більшість білків організму, особливо ферментних, існують в декількох ізоформах і схильні до таких мутаційні змін, які ведуть до патології.

Патологічні мутації різні за здатністю зберігатися і поширюватися в популяціях. Одні з них, що дозволяють їх носію зберігати плодючість і не викликають серйозних несприятливих зрушень в фенотипі, можуть передаватися з покоління в покоління тривалий час. Такі ознаки сегрегують (розподіляються) в поколіннях згідно із законами Менделя, і зумовлений ними генетичний вантаж в популяціях може довго зберігатися. Деякі комбінації умовно патологічних рецесивних алелей можуть давати виборче право індивідам (виживаність, плодючість). Частота таких алелей в популяції буде підвищуватися до певного рівня в ряду поколінь, поки не настане рівновага між інтенсивністю мутаційногопроцесу і відбору. Частота різних мутантних алелів цього роду може бути неоднаковою в різних популяціях, що визначається популяційних закономірностями (ефект родоначальника, частота кровноспоріднених шлюбів, міграція та екологічні умови). Під ефектом родоначальника на увазі накопичення патологічних мутацій в обмеженою популяції від одного носія хвороби групі нащадків.

Якщо знову виникла мутація має домінантне патологічне прояв і веде до летального генетичному результату (індивід не залишає потомства), то такий мутаційний вантаж не передається наступному поколінню. Це зазвичай домінантні форми важких хвороб, а також велика частина хромосомних хвороб.

В цілому ефекти генетичного вантажу у людини виражені в еволюційно-генетичних явищах збалансованого поліморфізму, летальності і зниженою фертильності.

На основі постійно протікають процесів зміни спадковості (мутацій) і відбору генотипів при тривалій еволюції людини в популяціях сформувався збалансований поліморфізм. Під цією назвою розуміють таке явище, коли в популяції представлені дві форми алелей одного гена або більше, причому частота рідкого алеля складає не менше 1%. Оскільки виникнення мутацій - рідкісна подія (1 х 10-7), То, отже, частоту мутантного аллеля в популяції більш 1% можна пояснити тільки якимось селективним перевагою цього алеля для організму і поступовим накопиченням в ряду поколінь після його появи. Прикладами збалансованого поліморфізму є групи крові АВО, резус, гени муковісцидозу, фенілкетонурії, первинного гемохроматозу. Генетичне різноманіття людини засноване на збалансованому поліморфізм, формувався протягом десятків і сотень тисячоліть. Таке різноманіття - основа розвитку людини як біологічного виду. Імовірність виникнення і фіксації в популяціях будь-якої мутації з позитивним ефектом в еволюційно «налагодженому» людському організмі існує і в даний час, але вона вкрай мала. Практично нові мутації завжди дають негативний ефект.

До ефектів мутаційного вантажу відноситься летальність. Вона проявляється загибеллю гамет, зигот, ембріонів, плодів, смертю дітей. Найбільш інтенсивно летальні ефекти виражені в людських популяціях на рівні зигот. Приблизно 60% зигот гине до імплантації, т. Е. До клінічно реєстрованої вагітності. Результати всіх клінічно зареєстрованих вагітностей розподіляються наступним чином: спонтанні аборти - 15%, мертвонародження - 1%, живорождения - 84%. З 1000 живонароджених дітей не менше 5 вмирають у віці до року через спадкової патології, несумісної з життям. Такий обсяг летального вантажу мутаційної мінливості в популяціях людини з медичної точки зору.

Для більшості спадкових хвороб характерна знижена фертильність, обумовлена ??порушенням репродуктивної функції. Це веде до зменшеного відтворення потомства (і хворого, і здорового) в сім'ях із спадковою патологією.

Медичні і соціальні наслідки мутаційногопроцесу: соціальна дізадаптаціі (інвалідність) хворих, підвищена потреба в медичній допомозі і знижена тривалість життя.

Молекулярні механізми генних мутацій.Генетичний матеріал - ДНК - дуже лабилен. Він може змінюватися, мутувати в результаті як зовнішніх, так і внутрішніх впливів. Підсумком виникаючих змін, якщо вони відбуваються в соматичних клітинах (а вони відбуваються безперервно з найпершої хвилини існування нового людського організму - зиготи - до останньої хвилини його життя), є численні хвороби, включаючи ракові пухлини і, мабуть, старіння і смерть. Якщо ж вони відбуваються в клітинах статевого шляху, то виникають мутації, які можуть в процесі еволюції закріплюватися і поширюватися в популяції і приводити до поліморфізму, якщо вони не відсіваються в силу випадкових причин або в силу їх шкідливого впливу на життєздатність індивідуума і його потомства.

В цілому різноманітність генів залежить від швидкості мутацій, розміру і демографічної історії популяції, в якій відбуваються мутації, часу, протягом якого відбувається накопичення цих відмінностей і селекції. Ступінь різноманітності, яке може підтримуватися в популяції, прямо пропорційна її розміру. Порівняно невелика варіабельність в популяції людини (варіабельність генома шимпанзе - нашого найближчого родича - значно вище, ніж у людини) є результатом її молодого віку і походження від порівняно невеликої початкової популяції.

Шкідливі мутації постійно виникають, але швидко відсіюються з популяції. Існує баланс між знову виникають мутаціями і їх відсіювання селекцією. В результаті шкідливі мутації, що викликають хворобу, володіють двома властивостями: вони зустрічаються рідко, і кожна конкретна мутація, яка існує в популяції, виникла недавно. Що стосується звичайного поліморфізму, то механізм його підтримки в популяції, незважаючи на тривалу і інтенсивну дискусію з цього приводу, не зрозуміле і, можливо, проясниться, коли вдасться досить швидко і порівняно недорого порівнювати безліч геномів і провести кореляції між частотами певних алелей і історіями різних популяцій .

У молекулах ДНК можуть відбуватися зміни послідовності нуклеотидів. Такі зміни, якщо вони зачіпають функціонально активні гени, можуть призводити до порушень метаболізму або функцій (ознак). Якщо ці зміни не призводять до загибелі організму або клітини - вони можуть передаватися у спадок. Отже, генні мутації - це стабільні зміни структури генів, що повторюються в наступних циклах реплікації і проявляються у потомства у вигляді нових варіантів ознак. Всі різновиди мутацій пов'язані зі зміною нуклеотидної послідовності генів.

Класифікація генних мутацій. За особливостями структурних змін можна відзначити кілька груп різноманітних мутацій:

· Заміна одних азотистих основ іншими (транспозиція) (рис.33.);

· Зміна кількості нуклеотидних пар в структурі гена (Дуплікація, инсерция, делеция);

· Зміна порядку послідовності нуклеотидів у складі гена (інверсії);

· Розрив ланцюгів;

· Освіту зшивок.

Заміна азотистих основ. Причинами цього роду мутацій є:

а) помилки реплікації,

б) вплив певних хімічних агентів.

Під впливом хімічних агентів може відбуватися порушення структури азотистого підстави вже приєднаного нуклеотиду. Наприклад, під впливом азотної кислоти може відбуватися мимовільне дезаминирование цитозину. В результаті цього цитозин перетворюється в урацил. Надалі в циклі реплікації урацил з'єднується аденином, який в наступному циклі приєднує тімідіновий нуклеотид.

Ще однією причиною може бути помилкове включення в утворюється ланцюг ДНК нуклеотиду зі зміненим підставою. Якщо це залишається непоміченим ферментами репарації, змінене підставу включається в процес реплікації, що може привести до заміни основної пари на іншу.

Рис.33. Схема виникнення мутації (транспозиції) за механізмом заміни одного азотистого підстави іншим

Мутації в результаті заміни азотистих основ виникають спочатку в одному з ланцюжків ДНК. Якщо вони не справляються в ході репарації, то при наступних реплікації вони закріплюються в обох ланцюгах молекули. Наслідком цього є утворення нового триплетів в генетичному коді ДНК. Це може відбитися на первинну структуру кодованого білка, його просторової організації та функції. Зміни первинної структури пептиду не відбудеться в тому випадку, якщо новий триплет є «синонімом» колишнього, т. Е. Буде кодувати ту ж амінокислоту. Наприклад, амінокислота лейцин кодується шістьма триплету: УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Заміна одного з нуклеотидів в цих триплетах не змінить його «сенсу». Цей приклад демонструє біологічне значення надмірності генетичного коду. Однак в більшості випадків заміна однієї амінокислоти на іншу призводить до серйозних наслідків. Наприклад, заміна глутамінової кислоти валіном в молекулі гемоглобіну призводить до зміни його структури і функцій. В результаті цього у людини розвивається хвороба - серповидно-клітинна анемія. У ряді випадків заміна азотистих основ може призводити до появи нонсенс-кодонів некодуючих амінокислот. Наслідком цього буде дострокове переривання процесу синтезу. Вважається, що заміна азотистих основ призводять в - 25% випадків до утворення триплетів-синонімів, в ~ 5% випадків - до утворення нонсенс- кодонів, і в ~ 70% - до виникнення генних мутацій.

Зміна кількості нуклеотидів в гені. Ця мутація - результат випадання (делеції) або вставки (инсерции) однієї або декількох пар нуклеотидів в молекулу ДНК (рис. 34). Такий тип мутацій зустрічається досить часто. Вказана зміна відбувається внаслідок впливу на ДНК деяких хімічних агентів, а також радіоактивного опромінення. Результатом цієї мутації є зрушення рамки зчитування інформації з генетичного коду. Наслідком цього є синтез поліпептидів зі зміненою амінокислотною послідовністю, порушення структури і функцій білків, порушення фенотипу. Однак якщо кількість відновлених або втрачених нуклеотидів кратно трьом, то зрушення рамки не відбувається. У цьому випадку в білку може з'явитися зайва амінокислота або буде на одну менше. Однією з причин мутацій, що призводять до зміни кількості нуклеотидів, є вставки або делеції в результаті активності рухомих генетичних елементів. Це певні нуклеотидні послідовності, вбудовані в геноми багатьох організмів. Ці структури ДНК здатні мимовільно змінювати своє положення в результаті помилок при рекомбінації.

Рис.34. Схема зміни кількості нуклеотидів

Зміна нуклеотидноїпослідовності гена (інверсія). Цей тип мутації пов'язаний з поворотом певної ділянки ДНК на 180 °. Такі порушення відбуваються внаслідок дії хімічних агентів і ряду фізичних факторів на молекулярно-генетичні
 процеси реплікації і рекомбінації. Наслідком цього є порушення нуклеотидної послідовності гена. Це призводить до зміни первинної структури поліпептиду, порушення структури і функції білка, порушення фенотипу.

Розриви однієї з ланцюгів можуть відбуватися під дією іонізуючої радіації, в результаті пошкодження хімічних зв'язків між нуклеотидами (рис. 35). Дефекти можуть відновлюватися ферментом лігази.

 
 

Рис.35. Схема виникнення мутації в результаті інверсії

Зшивання нуклеотидів, наприклад, двох поруч стоять тимін, відбувається під дією ультрафіолетового опромінення. Це призводить до помилок транскрипції.

«Мутон». Цим терміном називають мінімальну кількість генетичного матеріалу, здатного до мутації, що призводить до появи нового варіанту ознаки. У вищевикладеному матеріалі наведено шовні типи мутацій. У всіх випадках видно, що досить змінити тільки одну пару комплементарних підстав в гені, щоб цінувати властивості білка. Тобто мутон відповідає одній парі комплементарних нуклеотидів.

Рекон. Цим терміном називають мінімальну кількість генетичного матеріалу, зміна якого в результаті рекомбінації кросинговеру призводить до мутації і появи нового варіанту ознаки. Такі процеси можуть приводити до зрушення рамки зчитування порушення синтезу необхідного білка. Наукові дослідження побувають, що досить рекомбінації однієї пари комплементарних нуклеотидів, щоб відбулася мутація. Отже, рекон відповідає одній парі комплементарних нуклеотидів.

Множинні алелі. Різні структурно фунціональном варіанти гена називають алелями. Вони відрізняються невеликими змінами в нуклеотидної послідовності. Це забезпечує варіації в прояві ознаки. Аллели розташовуються в одних і тих в ділянках (локусах) гомологічних хромосом. Наявність в генофонді популяції більше двох варіантів алельних генів називають множинними алелями. Причиною множинного алелізм є різноманітні мутації і рекомбінації. Мутації можуть відбуватися в будь-яких ділянках гена. Вони призводять до того, що один і той же ген може брати участь в декількох варіантах. Якщо мутації не викликають загибель організму, вони зберігаються в генофонді виду, ніж зумовлюють появу нового варіанту ознаки в популяції.

Моногенні спадкові хвороби.Більшість форм спадкових захворювань обумовлено генними мутаціями, т. Е. Молекулярними змінами на рівні ДНК (муковісцидоз, гемофілія, фенілкетонурія, нейрофіброматоз, міопатія Дюшенна і т. Д.). Це генні хвороби.

Мутації транскрібіруемих ділянок (що визначають амінокислотну послідовність в молекулі синтезованого білка) призводять до синтезу аномального продукту, в той час як мутації нетранскрібіруемих областей можуть призводити до зниження швидкості синтезу незамінного білка різного ступеня вираженості. Фенотипічно генні мутації можуть проявлятися на молекулярному, клітинному, тканинному і органному рівнях.

Множинність метаболічних шляхів, функцій білків в організмі, обмеженість наших уявлень про нормальному метаболізмі ускладнюють розробку обґрунтованої етіологічної класифікації генних хвороб. Навіть число генних хвороб можна визначити тільки орієнтовно (3500- 4500), тому що немає строгих критеріїв нозологічних форм ні з клінічної, ні з генетичної точки зору. Наприклад, з клінічної точки зору міопатії Дюшенна (важка) і Беккера (легка). є різними формами, а з генетичної точки зору це результат мутації в одному і тому ж локусі. Встановлено, що міопатія Дюшенна розвивається при повній блокаді, а Беккера - при частковій блокаді синтезу РНК для дистрофина (при міопатії Беккера делеции гена за розміром менше).

Більш точно можна говорити про тих генах, в яких ідентифіковані хвороба- зумовлюють мутації. В даний час відомо близько 1100 таких генів. Однак можна очікувати, що найближчим часом на основі знань генома людини процес виявлення генів і мутацій в них буде прискорено. У зв'язку з тим, що різні мутації в одному і тому ж гені часто призводять до відрізняється порушень, загальна кількість хвороб з встановленої мутаційної природою можна вважати дорівнює 1500.

Успадкування патологічного гена (а в разі рецесивних мутацій - двох алелей) не завжди супроводжується розгорнутою клінічною картиною. Вище вже говорилося про можливий вплив факторів зовнішнього середовища на прояв генів. Однак і інші гени, що формують генотип особини, т. Е. Генетичну конституцію індивіда, можуть модифікувати прояв патологічного гена. У таких випадках говорять про неповну пенетрантності варьирующей експресивності. Оскільки генетична середовище для патологічного гена завжди індивідуальна, виникають широкі можливості для різного прояви цього гена у різних індивідів.

Багато генні мутації зумовлюють виникнення таких молекулярних форм білків, патологічна дія яких виявляється не в звичайних умовах, а тільки при взаємодії зі специфічними факторами зовнішнього середовища. Це так звані екогенетіческіе варіанти. Наприклад, у осіб з мутаціями в локусі глюкозо-6-фосфатдегідрогенази при лікуванні сульфаніламідами виникає гемоліз еритроцитів, у осіб з аномальною холінестеразою введення дитилина призводить до тривалої зупинки дихання.

У зв'язку з великим числом нозологічних форм генних хвороб, їх рідкістю, неповної клінічної та патологоанатомічної діагностикою спадкової патології дані по поширеності спадкових хвороб носять ще уривчастий характер. Однак за формами, за якими проводяться масові діагностичні або профілактичні програми, зібраний переконливий матеріал для судження про епідеміології генних хвороб.

Загальна частота новонароджених з генними хворобами в популяціях в цілому становить приблизно 1%, з них з аутосомно-домінантним типом успадкування - 0,5%, аутосомно-рецесивним - 0,25%, Х-зчепленим - 0,25%; Y-зчеплені і мітохондріальні хвороби зустрічаються вкрай рідко.

Поширеність окремих форм хвороб коливається від 1: 500 (первинний гемохроматоз) до 1: 100 000 і нижче (гепатолентикулярная дегенерація, атаксія-телеангіектазії та ін.).

Поширеність генної хвороби умовно можна вважати високою, якщо 1 хворий зустрічається на 10 000 новонароджених і чаші, середньої - 1:10 000- 1:40 000, низькою - дуже рідкісні випадки. До групи поширених входить не більше 15 генних хвороб, але вони обумовлюють майже 50% загальної частоти хворих зі спадковою патологією.

Мутаційний процес - одна з біологічних характеристик будь-якого виду. Він постійно протікає у людини в зародкових і соматичних клітинах і є основою виникнення і підтримки генетичної різноманітності людини. У той же час це первинне джерело виникнення спадкових хвороб. За різними оцінками, частота виникнення мутацій (спонтанний рівень) у людини орієнтовно становить 1 х 10-3-1 х 10-7 генів на покоління, т. Е. Мутаційні події в кожному гені досить рідкісні. Лише в декількох генах мутації виникають з підвищеною частотою (1 на 104 гамет). Ці гени відрізняються від інших надзвичайно великими розмірами (360 000 пар нуклеотидів в гені нейрофіброматозу і 2х106 - в гені міопатії Дюшенна-Беккера).

Таким чином, поточний мутаційний процес на генному рівні в одному поколінні не може забезпечувати спостерігається високої частоти патологічних алелей в популяціях. За приблизними непрямими оцінками (а точні прямі поки неможливі) загальний внесок мутаційногопроцесу в поширеність спадкових хвороб становить близько 20% їх загального числа.

Рис.36. Схеми різних хромосомних аберацій

Молекулярні і цитологічні механізми хромосомних мутацій. Такі мутації пов'язані зі зміною структури та розмірів хромосом. Їх також називають хромосомними перебудовами або хромосомною аберацією. Порушення структури хромосом є наслідком порушення процесів кросинговеру, мейозу або мітозу, а також дією інших факторів, що призводять до утворення фрагментів. Такі фрагменти можуть в подальшому навіть возз'єднатися, але без відновлення нормальної структури. Розрізняють внутрішньо-і міжхромосомні перебудови. Серед внутріхромосомних аберацій

виділяють наступні (рис.36.): делеция - нестача внутрішніх ділянок хромосом; Дуплікація - подвоєння ділянок хромосоми; інверсія - поворот ділянки хромосоми на 180 °; транслокация - переміщення ділянки з одного місця хромосоми в інше.

Причинами транслокаций є помилки молекулярно-генетичних процесів рекомбінації і ділення генетичного матеріалу. Міжхромосомні перебудови-транслокации пов'язані з переміщенням відірвалася ділянки хромосоми на інше місце негомологичной хромосоми (хромосоми з іншої пари). Ділянка хромосоми, що відокремився при розриві, може бути втрачений кліткою при черговому митозе, якщо він не мав центромери. Але частіше такий фрагмент прикріплюється до однієї з хромосом. Розрізняють декілька видів транслокаций: а) реципрокні - взаємний обмін ділянками між негомологічної хромосоми, б) нереціпрокние (транспозиції) - приєднання фрагмента до своєї ж хромосомі в іншому місці, в) полицентрические і ін.

Хромосомні перебудови призводять до зміни морфології хромосом, що помітно навіть у світловий мікроскоп. При цьому метацентріческая хромосоми можуть перетворюватися в субметацентріческіе, акроцентріческіе, і навпаки. Можуть з'явитися кільцеві і полицентрические хромосоми.

Структурні перебудови хромосом статевих клітин змінюють генетичний баланс і генетичні програми розвитку і функціонування ембріона. Змінюється характер взаємодії генів і їх функціонування. Це негативно позначається на структурі та функції клітин, органів і призводить до серйозних наслідків. Найчастіше мутації виявляються несумісними з розвитком нового організму або зумовлюють появу патологій. Однак деякі перебудови хромосом можуть бути корисними для еволюції. Наприклад, у людини 23 пари хромосом, а у сучасній людиноподібної мавпи 24 пари. Передбачається, що істотним етапом еволюції людини є робертсоновской транслокация - злиття 12 і 13 хромосоми мавп, і освіту другий хромосоми людини, яка майже повністю відповідає за генетичним складом своїм попередникам. В результаті цього відбулася зміна числа пар хромосом і комбінацій генів, що, ймовірно, стало однією з причин появи людини. Решта хромосоми людини практично схожі з хромосомами шимпанзе, хоча є деякі відмінності, наприклад, періцентріческіе інверсії 4, 5, 12, 17 хромосом.

Хромосомніаберації виявляються цитогенетичним методом під світловим мікроскопом. У людини відома транслокаціонная форма хвороби Дауна, коли частина 21 хромосоми під час мейозу приєднується до 15-ї та разом з нею через гамети потрапляє в зиготу, де з'являються три 21 хромосоми. Великі хромосомніаберації в зиготах призводять до тяжких аномалій, несумісних з життям або загибелі зародків на початкових стадіях ембріогенезу.

Сучасні методи вивчення каріотипу людини. Хромосомний комплекс виду з усіма його особливостями: числом хромосом, їх формою, наявністю видимих ??в світловий мікроскоп деталей будови, генним і алельним складом називається каріотипом. Специфічність набору хромосом для кожного виду. Всі живі організми мають постійне число специфічних хромосом в кожній соматичної клітці. Диплоидное число хромосом (2п) для людини - 46, для дрозофіли - 8, для коня - 66, шимпанзе - 48, собаки - 78 і т. Д. Гаплоїдноє число (п) для людини - 23, дрозофіли - 4 і т. Д . Гамети зазвичай містять тільки один набір хромосом.

Число хромосом в каріотипі індивідуума не залежить від висоти організації виду і не вказує на філіпченкове спорідненість, т. К. Одне і те ж кількість хромосом може зустрічатися у дуже далеких один від одного видів. Особливість проявляється в тому, що кожен вид організмів має специфічний набір хромосом певної форми і розмірів. А головне, хромосоми організмів різних видів мають свій Унікальний набір генів, що визначають розвиток індивідуумів тільки відомі види.

Мікроскопічні методи вивчення хромосом людини застосовуються з кінця XIX століття. З'єднання цитологічного спостереження хромосом з генетичним аналізом сегрегації і зчеплення генів призвело до народження цитогенетики. Термін «цитогенетика» введений В. Саттоном в 1903 р Спочатку цитогенетика концентрувалася на проблемах кореляції генетичних і цитологічних (хромосомних) ознак. В подальшому цитогенетика методично відокремилася від генетики, і під терміном «цитогенетика» розуміють область науки, що вивчає структуру і функції хромосом.

Цитогенетичні методи призначені для вивчення структури хромосомного набору або окремих хромосом. Найбільш поширеним методом в цитогенетики людини є світлова мікроскопія. Електронна і конфокальна лазерна мікроскопія застосовується в сучасній цитогенетики тільки з дослідницькими цілями. У всій медико-генетичної практиці застосовується світлова мікроскопія (головним чином в світлі), включаючи люмінесцентну мікроскопію.

Об'єктом цитогенетичних спостережень можуть бути діляться соматичні, мейотіческіе і інтерфазна клітини. Кожен з цих об'єктів має переваги і недоліки. Вибір об'єкта визначається метою дослідження. Більшість цитогенетичних досліджень виконується на соматичних клітинах.

Отримання препаратів митотических хромосом. Перше головна умова цитогенетичної діагностики - наявність клітин, які діляться в цитологічному препараті.

Кістковий мозок, тканини насінники і хоріон мають достатній мітотичний індекс для того, щоб використовувати ці об'єкти для цитогенетичних цілей. Однак, як показав досвід, незрівнянно більш інформативним дослідження на культурах клітин: клітини звільнені від елементів сполучної тканини і добре суспендуючі. Мітотичний індекс в культурі клітин набагато вище, ніж в тканинах організму.

Культури клітин можна отримувати зі шматочків шкіри (ростуть фібробласти), кісткового мозку, ембріональних тканин, хоріона, клітин амніотичної рідини. Найбільш зручним об'єктом для медичних генетиків виявилася культура лімфоцитів периферичної крові. Для її отримання досить взяти 1-2 мл венозної крові і додати її в суміш живильного середовища з фитогемагглютинином (білок бобових рослин). Останній викликає імунологічну трансформацію лімфоцитів і їх розподіл. Тривалість культивування становить 48-72 год.

Другим методичним умовою цитогенетичних досліджень є використання колцемідом (або колхіцину), що руйнує веретено поділу і зупиняє клітинний розподіл на стадії метафази. Мітотичний індекс в культурі клітин за 2-3 год підвищується в 2-3 рази. Навіть без культивування експозиція з колцемідом збільшує число метафаз. Хромосоми в присутності колцемідом коротшають за рахунок триваючого конденсації і, отже, в препараті вони легше відокремлюються одна від одної. У тих випадках, коли необхідний детальний аналіз певного району хромосоми, сильно конденсовані хромосоми на стадії метафази (метод називається метафазних) непридатні для аналізу. Для цих цілей клітина повинна бути зафіксована на стадії, що передує метафазі, коли хромосома редуплікованих, але ще не повністю конденсувалась. Ця стадія - стадія прометафазі. Хоча хромосоми на даній стадії погано роз'єднані (вони ще дуже довгі) і на препараті є багато накладень однієї хромосоми на іншу, все ж в окремих клітках можна знайти ділянку, необхідний для аналізу. Цей метод (або підхід) на відміну від метафазну методу називають прометафазних або методом високоразрешающей цитогенетики. Суть методичного втручання при даній модифікації методу полягає в припиненні процесу спирализации і конденсації хромосом в профазі за допомогою препаратів, які вводять в культуру клітин за кілька годин до фіксації.

Диференціальне фарбування хромосом.Метод простий забарвлення хромосом як єдиний метод вивчення каріотипу людини застосовувався до початку 70-х років. У 70-х роках в практику увійшли методи диференціального фарбування і хронології реплікації ДНК в хромосомах.

Диференціальне фарбування забезпечується порівняно простими температурно-сольовими впливами на фіксовані хромосоми. При цьому виявляється структурна диференціювання хромосом по довжині, що виражається у вигляді чергування ЕУ і гетерохроматичному районів (темні і світлі смуги). Протяжність цих ділянок специфічна для кожної хромосоми, відповідного плеча та району. Як видно з рис. 37. б, при диференціальної забарвленні ідентифікуються всі хромосоми, плечі і навіть певні райони. Кожна хромосома має свій малюнок смугастість. При диференціальної забарвленні метафазних хромосом в каріотипі можна оцінити близько 200-400 ділянок. Така роздільна можливість методу.

Мал.37. Каріотипи при простий (а) і диференціальної (б) забарвленням

Спочатку при спеціальному фарбуванні хромосом використовували флюоресцентні алкилирующее речовина акрихін-іприт. Цей варіант був названий Q-методом. Даний метод вимагає швидкої обробки препарату, що не завжди зручно. Для перегляду препарату треба користуватися люмінесцентним мікроскопом.

В подальшому була розроблена методика диференціальної забарвлення без флюоресцентних барвників. Найбільш широко використовується G-забарвлення (Гимза). При цьому хромосоми попередньо обробляють (або інкубація в сольовому розчині, або обробка протеазой). Попередня обробка частково порушує структуру хромосом, яка в деяких ділянках відновлюється при фарбуванні, що і надає хромосомі індивідуальну смугастість, або смугастість. Механізм утворення сегментів поки недостатньо ясний. Передбачається, що пофарбовані сегменти - гетерохроматіновие, пізно реплікується ділянки хромосом з повторюваними послідовностями ДНК, а незабарвлені - еухроматіновие ділянки, в яких розташовані кодують послідовності.

Для ідентифікації хромосом, крім методів виявлення лінійної структурної диференційованості, можна скористатися однією з важливих характеристик хромосом людини - асинхронність їх реплікації по довжині (мал.38).

«Малюнки» послідовності реплікації (рано чи пізно реплікується ділянки) специфічні для кожної хромосоми. для виявлення

 
 


Мал.38. Метафазну пластинка з диференціальної забарвленням сестринських хроматид

послідовності реплікації застосовується аналог тимідину 5-Бромдена-зоксіурідін. Ділянки хромосоми, що включили цей аналог, фарбуються погано. Використовуючи цей метод, можна ідентифікувати будь-яку хромосому або хромосомну перебудову. Введення аналога 5-бромдезоксіурідіна в культуру на 24 год і більше застосовується для диференціальної забарвлення сестринських хроматид. Якщо 5-бромдезоксіурідіна ввести на повний клітинний цикл, то знову утворена хроматида включить аналог тимідину і буде фарбуватися слабо. Інша хроматида (стара) забарвлюється, як зазвичай, інтенсивно (мал.38.). Цей метод дозволяє легко виявляти обміни між сестринськими хроматидами (схо), число яких збільшується при спадкових хворобах з хромосомної нестабільністю (анемія Фанконі, пігментна ксеродерма і ін.). Число схо збільшується також при мутагенних впливах, тому метод обліку схо широко використовується при вивченні мутаційногопроцесу у людини.

Молекулярно-цитогенетичні методи. Завдяки успіхам молекулярної генетики людини розроблений принципово новий метод вивчення хромосом - метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH). Принцип цього методу полягає в наступному (схема):

Для досліджуваної хромосоми або конкретного її ділянки, виходячи з специфічності послідовності основ ДНК, готують однонитевой ділянку ДНК, до якого приєднується біотин або дігоксігенін. Такий «позначений» ділянку ДНК називається зондом.

На мікроскопічному препараті in situ при лужній обробці хромосомная ДНК денатурируется, т. Е. Розриваються зв'язки між двома нитками ДНК.

Зондом обробляють препарат. Оскільки послідовність основ ДНК-зонда і відповідну ділянку хромосоми взаємно комплементарні, то зонд приєднується до хромосоми. У цій ділянці відбувається ренатурації ДНК.

Після цього препарат обробляють речовиною, яке завдяки своїй структурі здатне вибірково приєднатися до біотину або дігоксігеніну. Як видно на схемі, для біотину такою речовиною є стрептовідін, для дігоксігеніна - антідігоксігеніновое антитіло. До цих речовин можуть бути приєднані в один або два етапи флюоресцентні барвники (родамін - червоний колір або флюоресцеин изотиоцианат - зелений колір).

За допомогою люмінесцентного мікроскопа пофарбовані хромосоми візуалізуються на тлі нефарбованих.

На схемі розглянута подвійна гібридизація. Сучасні методичні можливості дозволяють збільшити число квітів.

Межі застосування методу FISH дуже широкі: від локалізації гена до розшифровки складних перебудов між декількома хромосомами. Слід підкреслити, що з'єднання молекулярно-генетичних і цитологічних методів робить майже необмеженими можливості діагностики хромосомних аномалій, як дуже складних, так і дуже дрібних за розмірами.

Мал.39. Схема подвійний специфічної флюоресцентной гібридизації in situ

Дво- і триколірна флюоресцентная гібридизація in situ застосовується для обліку симетричних хромосомних аберацій у осіб, опромінених багато років тому іонізуючим випромінюванням. Зазначений метод вимагає менше часу, ніж кариотипирование диференційно забарвлених метафаз (рис.39.).

У клінічній цитогенетиці метод FISH займає все більше місце. У випадках складних хромосомних перебудов, захоплюючих більше двох хромосом, диференціальна G-забарвлення не завжди дозволяє ідентифікувати змінені сегменти хромосом. У цих випадках застосовують триколірний варіант методу FISH. Наприклад, у дитини з множинними вродженими аномаліями при G-аналізі виявлено складні перебудови в 6 хромосомах (1,4. 7, 8, 9 і 12) з 10 розривами. Повна ідентифікація розривів можлива тільки за допомогою FISH-забарвлення.

Метод FISH може застосовуватися для діагностики анеуплоїдій в інтерфазних ядрах. Принцип методу в цьому варіанті такий же, як і для метафазних пластинок (описаний вище). Наприклад, специфічний для хромосоми 21 зонд ДНК, з'єднаний з біотином, гібрідізіруют з денатурованими клітинами з амніотичної рідини на предметному склі. У нормі, т. Е. Якщо у плода є дисомія по хромосомі 21, в ядрі буде видно дві флюоресцирующие відповідним кольором точки. Якщо у плода трисомия, то в ядрі буде видно 3 точки. Такий методичний прийом називають інтерфазної цитогенетикою. Метод простий, економічний і потребує мало часу (кілька годин).

Метод порівняльної геномної гібридизації (CGH- comparative genome hybridization). Область використання методу - онкологічна цитогенетика. Призначення методу - визначення районів хромосом, які делегуються або амплифицируют в певному типі пухлини. Райони делеций, як правило, містять гени-супресори пухлинного росту, а райони ампліфікації містять онкогени. Таким чином, метод використовується переважно для картування і клонування генів, залучених в канцерогенез.

Іноді буває досить складно отримати хромосомні препарати хорошої якості з солідною пухлини або у хворих з гематологічними онкозахворюваннями, тому був розроблений оригінальний метод непрямого аналізу хромосом в пухлини. Суть методу CGH в тому, що з пухлини виділяють ДНК і мітять її певним флюорохромом. ДНК, виділену з нормальної тканини, мітять іншим флюорохромом. Хромосомні препарати готують стандартним способом з лімфоцитів периферичної крові контрольного індивіда. Мічену ДНК з пухлини і зміненою тканини гібрідізіруют з хромосомним препаратом. За інтенсивністю світіння мітки визначають області делеций і ампліфікації. Область дозволу -5-10 млн пар нуклеотидів. Для обробки даних використовують програми комп'ютерного аналізу хромосом.

Спектроскопічний аналіз хромосом (SKY). Цей метод використовує флюоресцентні барвники, що мають спорідненість до певних ділянок хромосом. При використанні набору специфічних зондів з різними барвниками кожна пара хромосом має свої унікальні спектральні характеристики. Особливість методу - використання інтерферометра, аналогічного використовуваним для вимірювання спектра астрономічних об'єктів. Незначні варіації в спектральному складі, невиразні людським оком, враховуються при комп'ютерній обробці, і потім програма призначає кожній парі хромосом легко розпізнаються кольору. Результат у вигляді кольорового зображення частіше використовується в цифровій формі. Аналіз каріотипу значно полегшується, оскільки гомологічні хромосоми мають один і той же колір, а аберації стають легко помітними. Крім того, спектральний кариотипирование використовується для виявлення транслокацій, нерозпізнаних традиційними методами. Область використання методу - онкоцітогенетіка. Завдяки такому підходу вдається точно описати множинні структурні перебудови хромосом, що відбуваються в пухлинних клітинах. У клінічній цитогенетиці вдається визначати дуже незначні за величиною транслокации, инсерции і маленькі маркерні хромосоми. Однак використання методу обмежена високою вартістю устаткування для аналізу.

Показання для цитогенетичного дослідження досить широкі, особливо при акушерсько-гінекологічної та дитячої патології. Нижче наводиться перелік (можливо, неповний) станів, при яких з діагностичними цілями треба мати результати цитогенетичного дослідження, проведеного у пацієнта (пробанда) і при необхідності у його родичів.

Підозра на хромосомну хворобу по клінічній симптоматиці (для підтвердження діагнозу).

Наявність у дитини множинних вроджених вад розвитку, що не відносяться до генному синдрому.

Багаторазові (більше двох) спонтанні аборти, мертвонародження або народження дітей з вродженими вадами розвитку.

Порушення репродуктивної функції неясного генезу у жінок і чоловіків (первинна аменорея, безплідний шлюб і ін.).

Істотна затримка розумового і фізичного розвитку у дитини.

Пренатальна діагностика (за віком, у зв'язку з наявністю транслокации у батьків, при народженні попереднього дитини з хромосомною хворобою).

Підозра на синдроми, що характеризуються хромосомної нестабільністю (облік хромосомних аберацій і схо).

Лейкози (для диференціальної діагностики, оцінки ефективності лікування та прогнозу перебігу).

Оцінка мутагенних впливів (радіаційних, хімічних). Медичних обмежень для застосування цитогенетичних методів немає.

Однак необхідно пам'ятати, що ці методи трудомісткі, дорогі, призначення їх навмання невиправдано (за принципом «якщо неясно, то давайте призначимо»). Правильніше призначати цитогенетическое дослідження за рекомендацією лікаря-генетика після проведення медико-генетичного консультування. Досвід роботи зарубіжних медичних установ показав необхідність створення цитогенетичних лабораторій при великих багатопрофільних лікарнях та медико-генетичних консультаціях, комплексно обслуговують будь-якої район або місто. В Україні цитогенетичні дослідження проводяться в медико-генетичних кабінетах і медико-генетичних консультаціях.

Класссіфікація мутацій унаслідок виникнення. Залежно від причин виникнення мутації можуть бути спонтанні або індуковані. Спонтанні - це мутації, які відбуваються в природі раптово без видимих ??причин під дією якихось чинників. Індуковані - це мутації, що відбуваються при направленому впливі певних мутагенів.

До 1925-1927 рр. генетики мали справу тільки зі спонтанними мутаціями. Різні спроби підвищити частоту мутацій, в тому числі і вжиті Т. X. Морган, не приносили успіху. Складалося враження, що мутаційний процес не залежить від навколишнього середовища. Це стимулювало генетичний концепції, згідно з якими еволюцію організмів пов'язували тільки з дією внутрішніх факторів.

Оволодіння методами індукованого мутагенезу зіграло величезну роль в боротьбі з такими тенденціями, а також розширило можливості генетичного аналізу. Вперше підвищення частоти спадкової мінливості під впливом зовнішніх агентів виявили в 1925 р радянські мікробіологи Г. А. Надсон і Г. С. Філіппов. Вони спостерігали збільшення різноманітності спадкових форм - сальтантов, як вони їх назвали, після впливу «променями радію» на нижчі гриби.

У 1927 р Г. Меллер повідомив про дії рентгенових променів на мутаційний процес у дрозофіли і запропонував став класичним кількісний метод обліку рецесивних летальних мутацій в Х-хромосомі у цього об'єкта. Майже одночасно Л. Стадлер (1928) описав вплив рентгенових променів на мутаційний процес у ячменю. У тому ж році М. Н. Мейсель в лабораторії Г. А. Надсона отримав мутації у дріжджів під дією хімічних сполук (хлороформ та ін.).

У 30-х роках відкрито хімічний мутагенез у дрозофіли: спочатку В. В. Сахаров (1932), а потім М. Є. Лобашев і Ф. А. Смирнов (1934) показали, що деякі сполуки (йод, оцтова кислота, аміак) здатні індукувати рецесивні літали в Х-хромосомі. У 1939 р С. М. Гершензон відкрив сильний мутагенний ефект екзогенної ДНК у дрозофіли. Потужні хімічні мутагени були відкриті в 1946 р І. А. Рапопорт (етиленімін) в СРСР і Ш. Ауербах і Дж. Робсон (азотистий іприт) в Англії.

З тих пір в арсенал мутагенних чинників увійшли різноманітні хімічні сполуки: аналоги підстав, що включаються безпосередньо в ДНК, такі агенти, як азотиста кислота або гідроксиламін, модифікують підстави, з'єднання, алкилирующие ДНК (етілмегансульфонат, метілметансульфонат і ін.), З'єднання, інтеркалірующіе між підставами ДНК (акрихін і їх похідні), і багато інших. Поряд з мутагенами були знайдені речовини-антимутагени.

Можливість змінювати швидкість мутаційногопроцесу послужила вирішальним стимулом до з'ясування причин спонтанних мутацій. Одна з перших спроб пояснити причини спонтанних мутацій зводилася до припущення про те, що в дійсності їх індукує природний фон радіоактивності. Однак з'ясувалося, що таким шляхом можна пояснити виникнення лише близько 0,1% всіх спонтанних мутацій у дрозофіли. Не підтвердилася і гіпотеза про тепловому русі атомів як головну причину спонтанних мутацій. Були спроби пояснити спонтанні мутації результатом дії продуктів метаболізму клітини і організму.

Сучасна точка зору на причини спонтанних мутацій сформувалася в 60-х роках завдяки з'ясуванню механізмів відтворення, репарації та рекомбінації генів і відкриття ферментних систем, відповідальних за ці процеси. Виникла тенденція пояснювати генні мутації як помилки в роботі ферментів матричного синтезу ДНК. Зараз ця гіпотеза є загальновизнаною. Привабливість гіпотези полягає також в тому, що вона дозволяє розглядати і індукований мутаційний процес як результат втручання зовнішніх чинників в нормальне відтворення носіїв генетичної інформації, т. Е. Дає єдине пояснення причин спонтанних і індукованих мутацій. Великий вплив на розвиток теорії мутаційного процесу зробило вивчення його генетичного контролю. Були відкриті гени, мутації яких можуть підвищувати або знижувати частоту як спонтанних, так і індукованих мутацій. Ці та інші факти, переконливі аргументи на користь існування загальних причин індукованого і спонтанного мутаційного процесу.

Перше пояснення механізму мутаційних змін (генних мутацій і хромосомних аберацій) було запропоновано в 1935 р Н. В. Тимофєєвим-Ресовський, К. Ціммером і М. Дельбрюком на підставі аналізу радіаційного мутагенезу у вищих організмів і перш за все у дрозофіли. Мутація розглядалася як результат миттєвої перебудови атомів у складній молекулі гена. Причиною такої перебудови вважалося безпосереднє влучення в ген кванта або іонізуючої частинки або ж випадкові коливання атомів.

Відкриття в подальшому ефекту післядії іонізуючих випромінювань показало, що мутації виникають в результаті процесу, що триває в часі, а не безпосередньо в момент проходження кванта енергії або іонізуючої частинки через ген.

Перспективи подолання цих та інших суперечностей, що зароджується теорії мутаційного процесу були намічені в фізіологічної гіпотезі мутаційногопроцесу, висловленої 1946 р М. Е. Лобашева.

Сутність гіпотези М. Є. Лобашева полягала в тому, що «завдяки здатності клітини репарирувати отримані пошкодження становлення мутації має здійснюватися в процесі оборотності пошкодження, т. Е. В процесі відновлення (репарації)». Це означало, що появі мутації має передувати предмутаціонное стан або потенційне зміна, яке може бути усунуто (тотожна репарація) або реалізується в вигляді мутації (нетотожності репарація). Для доказу існування таких предмутаціонних станів М. Є. Лобашев, його учні К. В. Ватт, М. М. Тихомирова та інші в дослідах з дрозофіли, облученной рентгеновимі променями, додатково впливали на неї високою температурою, яка сама по собі мутацій практично не викликала. Мухи, піддані такому комбінованому впливу, виявляли більш високу мутабільність, ніж після впливу тільки рентгеновимі променями.

Незважаючи на те, що фізіологічна гіпотеза мутаційного процесу була сформульована на основі загальноприйнятих у той час уявлень про білки як носіях генетичної інформації, вона виявилася справедливою і щодо молекул ДНК. Дійсно, багато ушкоджують агенти призводять до локальної денатурації молекул ДНК, а усунення цих порушень структури (репарація) - до виникнення мутацій. Зв'язок мутацій з процесами репарації в даний час доведено практично для всіх досліджених об'єктів. Нині фізіологічна теорія виросла з рамок гіпотези, символізуючи сучасний період у вивченні мутаційногопроцесу.

мутагенні фактори. Забруднення навколишнього середовища небезпечно не тільки нині живе поколінню, але часто становить небезпеку для прийдешніх поколінь, оскільки багато забруднювачі мутагенів (або, що майже те ж саме, генетично активні). Виявлення та усунення генетично активних факторів з середовища проживання людини - завдання генетичної токсикології, яка являє собою найбільш активно розвивається розділ екологічної генетики. Це пояснюється її величезним прикладним значенням.

Парадоксально, але факт, що відкриття індукованого мутаційного процесу потребувало значних зусиль від дослідників: згадаймо, що Г. дж. Меллер отримав Нобелівську премію за відкриття мутагенного дії рентгенових променів (1927 рік). Тепер же мутагени виявляються на кожному кроці. Багато продуктів виробничої діяльності людини, що з'являються як результат так званого технічного прогресу, володіють генетичною активністю. При цьому ми говоримо не тільки про відходи виробництва. Це можуть бути ліки, консерванти, харчові добавки та барвники, косметика, інсектициди і пестициди, не кажучи вже про дим сигарет та випромінювання, що супроводжують «мирний атом», тим більше зброя масового знищення - ядерне і хімічна. Складніше йде справа з новими, як правило антропогенними, факторами зовнішнього середовища, які ніколи не зустрічалися в природі в ході біологічної еволюції. Так, наприклад, багато інсектициди - хлоровані вуглеводні ніколи не існували в природі. Вони не трансформуються в харчових ланцюгах і тому нерозкладних біологічним шляхом, що не враховувалася при їх застосуванні. До них відносяться поліхлорбіфеніли, зокрема пестициди: 2,4-діхлорфеноксіуксусная кислота (2,4-Д) або 2,4,5-тріхлорфеноксіуксусная кислота (2,4,5-Т) - ефективні дефоліанти. Притчею во язицех стають останнім часом діоксини, також відносяться до поліхлоровані біфеніли і представляють собою найактивніші отрути, відомі в даний час. Один з них входив до складу сумнозвісного agent orange, що застосовувався армією США у В'єтнамі в якості бойового дефоліанту. Діоксини утворюються при спалюванні сміття у великих кількостях на заводах по знищенню міських відходів.

У списку найбільш значущих антропогенних чинників забруднення середовища (з 19 найменувань) перші п'ять місць займають: 1) пестициди; 2) важкі метали; 3) діоксид вуглецю; 4) діоксид сірки і продукти її окислення, суспензії; 5) розливи нафти, стічні води промислових підприємств. При цьому радіоактивні відходи, що володіють безсумнівною генетичної активністю, стоять тільки на 12-му місці як забруднювачі.

У генетичній токсикології прийнято говорити не тільки про мутагенні, а й, ширше, про генетично активних факторах. Не завжди вдається визначити безпосередньо мутагенний ефект того чи іншого впливу, але можна показати його вплив на кроссинговер, тобто на рекомбінацію генів або індукцію репаративного синтезу ДНК, що супроводжує багато пошкодження генетичного матеріалу.

Таким чином, мутагенез, рекомбінагенез і індукція репаративного синтезу ДНК - це показники генотоксичности або генетичної активності досліджуваного фактора.

Генетично активні чинники діляться на фізичні, хімічні та біологічні. До фізичних факторів належать температура, іонізуюча радіація, ультрафіолетове світло, мабуть, високочастотне електромагнітне випромінювання, ультразвук і т. Д. Хімічні генетично активні фактори набагато важче піддаються перерахуванню і класифікації. Досить сказати, що до них відносяться будь-які речовини, прямо або побічно порушують структуру і відтворення молекул ДНК. Вихлопні гази автотранспорту та викиди в атмосферу виробничих підприємств містять алкилирующие з'єднання (їх називають радіоміметікамі), органічні сполуки ртуті, поліциклічні вуглеводні, що володіють генетичною активністю. Багато хімічні сполуки самі по собі не виявляють генетичної активності, але їх легко активують внутрішньоклітинні метаболіти, а іноді і з'єднання, що знаходяться в навколишньому організм середовищі. Наприклад, поширені солі азотної кислоти легко перетворюються в нітрити (солі азотної кислоти) - мутагени, дезамінується підстави ДНК. У кислому середовищі шлунка ссавців нітрити і аміносо-єднання дають нитрозосоединения - супермутагени, що порушують реплікацію ДНК. Багато речовин, так звані промутагени, активуються в організмі ссавців при дії цитохрому P-450. Цей фермент, який синтезується в печінці, відноситься до класу неспецифічних монооксигеназ і призначений для інактивації чужорідних сполук, що потрапляють в організм. Але -450 разом з тим здатний активувати деякі промутагени. Більш того, він може активувати не тільки промутагени, а й потенційні канцерогени - речовини, що викликають рак. Необхідно відзначити високий рівень кореляції між мутагенними і канцерогенними ефектами багатьох факторів, насамперед фізичних і хімічних.

Особливий інтерес представляють біологічні генетично активні чинники. В кінці 30-х років С. м. Гершензон встановив мутагенний ефект ДНК і вірусів. Пізніше було з'ясовано, що хромосомніаберації в соматичних клітинах викликають віруси віспи, кору, вітряної віспи, грипу, гепатиту. Стрептолізин-О, токсин гемолитического стрептокока, підвищує частоту мутацій в культурі ембріональних фібробластів людини. У контролі частота хромосомних аберацій становить 4,0 ± 0,5%, а при дії токсину - 24,3 ± 0,6%. Ю. я. Керкис показав мутагенний ефект імунологічного стресу при пересадці і відторгнення в силу тканинної несумісності шкірного клаптя у мишей. Потужним мутагенів біологічного походження виявився афлатоксин - продукт життєдіяльності цвілевих грибів Aspergillusflavus.

Під керівництвом М. е. Лобашева ще в 60-і роки на кафедрі генетики та селекції Ленінградського університету були розпочаті експерименти, які довели роль нервової системи в контролі частоти хромосомних аберацій у соматичних клітинах (рогівці ока) у мишей. Розвиваючи цей напрямок, учні М. е. Лобашева (Р. і. Цапигіна, С. н. Новокому, Е. в. Даев) показали мутагенний ефект феромонального стресу у мишей. При цьому важливо, що мова йде вже про мутації не в соматичних, а в генеративних клітинах - при сперматогенезе. Схема зробленого експерименту представлена ??на рис. 40.

Рис.40. Вплив феромонального стресу на частоту хромосомних аберацій у мишей. Гістограма показує частоту аберацій в сперматогенезе: 1 - без додаткового впливу; 2 - результат приміщення мишей 30-денного віку на чисту підстилку; 3,4 результат приміщення мишей того ж віку на підстилку після перебування на ній самців 3-4-місячного віку.

Відомо, що запах у взаєминах мишей виконує функції своєрідної мови. Феромони, летючі речовини, що містяться в сечі цих тварин, грають роль сигналів, що викликають реакцію підпорядкування, агресії і т. Д. Користуючись цими сигналами, старі самці тримають в підпорядкуванні самок і молодих самців. Виявилося, що запах дорослого самця при одноразовому впливі підвищує частоту цитологічних порушень в сперматогенезе у молодих самців, збільшує частоту аномальних сперматозоїдів і домінантних летальних мутацій, що виявляються після їх спарювання з самками, які не піддавалися впливу.

Методи визначення мутагенної активності речовин. З деяких пір (у нас з 1979 року) все нові хімічні сполуки (а всього їх в побуті більш 4,5 млн) проходять перевірку на генетичну активність. Це своєрідна служба генетичної безпеки, що використовує багатий арсенал різних тест-систем для виявлення генетичної активності. Ці системи дозволяють враховувати мутації генів, їх рекомбінації, втрати та інші аберації хромосом, порушення поділів ядра, індукцію репарації ДНК і т. Д. При цьому використовуються різні об'єкти: бактерії, дріжджі та інші нижчі гриби, плодова мушка-дрозофіла, рослини, культура клітин тварин і людини.

Найбільший інтерес представляє генетична активність досліджуваних агентів для людини. Оскільки пряме дослідження їх дії на людину неможливо, доводиться обмежуватися результатами, одержуваними на модельних об'єктах. Ці результати в значній мірі справедливі і для людини через біологічної універсальності властивостей генетичного матеріалу - це завжди ДНК. Проте екстраполяція отриманих результатів на людину завжди представляє деякі складності, так як поряд з принципом біологічної універсальності слід враховувати і специфіку об'єктів, що мають свої особливості реагування на мутагени.

Як приклад розглянемо тільки одну тест-систему, що одержала широке поширення при первинному виявленні генетичної активності. Це система, розроблена в 60-і роки XX століття американським дослідником Б. Еймсом, який тривалий час вивчав мутації в генах, що контролюють біосинтез гистидина у Salmonella typhimuium. Робота Б. Еймса, прекрасний приклад того, як спочатку чисто теоретичне дослідження, спрямоване на з'ясування структури і функції гена, придбала суто практичне значення. Маючи в своєму розпорядженні детально охарактеризовані мутанти сальмонели, які потребують Гістидину, знаючи молекулярну природу мутаційних змін: заміни, вставки або випадання пар основ в ДНК гена або більші перебудови генетичного матеріалу, Еймс запропонував вивчати реверсії гистидинового мутантів, тобто відновлення у них здатності синтезувати гистидин, і, отже рости на середовищі без гистидина в результаті впливу різних мутагенів.

Тест дуже простий: досить засіяти середу без гистидина мутантом сальмонели, які потребують Гістидину (який природно не росте на такому середовищі), і нанести в центр використовуваної для цього чашки Петрі випробувані хімічна сполука. Через 2-3-е суток можна бачити поява колоній мутантів (в даному випадку ревертанти) навколо плями нанесеної речовини, якщо воно володіє генетичною активністю (рис.41.). Це приклад так званого спот-тесту (від англ. Spot - пляма). В даний час тест Еймса вдосконалений: поряд з добре вивченими мутаціями потреби в Гістидину в геном сальмонели вводять делецию по одному з генів репарації, тобто інактивують цей процес, тим самим підвищують чутливість бактерії до мутагенів. Вводять також мутацію, яка блокує синтез ліпополісахарідной капсули для підвищення проникності клітин, а також плазміди, що підвищують чутливість клітин до агентам, що підсилює рекомбінацію. Нарешті, випробувані речовина стали наносити разом з екстрактом мишачої або щурячої печінки, що містить цитохром Р450


Молекулярна організація генів. | РНК і її роль в збереженні і реалізації спадкової інформації. | Лікарські засоби, що впливають на синтез нуклеїнових кислот і білків. | Експресія генів і її регуляція | Регуляція експресії генів. | Контроль на рівні трансляції та посттрансляційних процесів. | Організація геномів неклітинних і клітинних організмів | ДНК-геноми | геном бактерій | Особливості плазмід. |

загрузка...
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати