На головну

індикація вірусів

Для виявлення (індикації) вірусів застосовуються такі методи.

Індикація вірусів в культурі клітинздійснюється, перш за все, по цитопатичної дії (ЦПД) вірусів, терміни і характер якого залежать від властивостей вірусу, проявляючись дегенеративними змінами клітин з наступною їх загибеллю і відшаруванням від скла (рис. 29).

Повна дегенерація клітин супроводжується значними змінами у вигляді пікнозу ядра і цитоплазми, відшаруванням клітинного моношару від скла. Часткова дегенерація культур клітин може протікати за такими типами:

гроздеобразованія (Округлення, збільшення і злиття клітин з утворенням гроздевідних скупчень, типово для аденовірусів),

осередкової деструкції (Вогнища уражених клітин на тлі в цілому зберігся моношару), характерною для вірусів грипу;

сімпластообразованія (Злиття клітин з утворенням гігантських багатоядерних клітин у вигляді симпластов або сінцітіев, характерних для вірусів кору, паротиту, парагрипу, респіраторно-синцитіальним, герпесу, імунодефіциту людини).

Проліферативний тип ЦПД з трансформацією клітин в злоякісні, що володіють необмеженими потенціями до зростання, здатні викликати онкогенні віруси.

Терміни, протягом яких настає ЦПД, варіабельні (наприклад, 1-2 дня у поліовірусов, 7-14 діб у аденовірусів).

Якщо в інфікованих культурах клітин ЦПД відсутня або слабко виражена, проводять «сліпі пасажі», тобто заражають культуральної рідиною нові культури клітин.

А б

Мал. 29. Культура клітин нирок мавп (а - незаражених, б - цитопатическое дію вірусу) х200

Індикація вірусів за допомогою реакції гемадсорбції (РГАДА).Сутність цієї реакції полягає в здатності еритроцитів людини або тварин адсорбироваться на поверхні клітин, інфікованих поруч вірусів (наприклад, орто і парамиксовирусов і ін.) В ранні терміни їх репродукції (до розвитку ЦПД) в результаті дії гемагглютининов - глікопротеїдів, що входять до складу суперкапсиду вірусу . Для постановки РГАДА в культуру клітин додають 0,2 мл 0,5% -й суспензії еритроцитів, витримують 15-20 хв при температурі 40, 200 або 370 З залежно від властивостей вірусу, після чого суспензію еритроцитів видаляють і проводять облік реакції під малим збільшенням мікроскопа по скупченню еритроцитів на окремих клітинах або на всьому монослое.

Індикація вірусів по кольоровий пробі. Принцип методу заснований на визначенні кислих продуктів метаболізму, що розжарюється в клітці в процесі її життєдіяльності за допомогою індикатора фенолового червоного, змінює свій колір з червоного в лужному середовищі на оранжево-жовтий в кислому середовищі. При зараженні культури клітин вірусами, що викликають ЦПД (наприклад, аденовіруси, ентеровіруси та ін.), Метаболізм клітин пригнічується, рН середовища не змінюється і вона залишається забарвленою в червоний колір.

Індикація вірусів по внутрішньоклітинним включень.Репродукція деяких вірусів (віспи, герпесу, сказу) призводить до утворення внутрішньоклітинних включень, що локалізуються в цитоплазмі або в ядрі клітин і представляють собою скупчення вірусу (або його антигенів). Включення виявляють шляхом світлової мікроскопії культур клітин, забарвлених по Романовським- Гімзою або іншими методами, а також за допомогою прямого флюорохромірованія (наприклад акридиновим помаранчевим) з подальшою мікроскопією препаратів в люмінесцентному мікроскопі.

Індикація вірусів за допомогою прямої РИФ -виявленіевірусних антигенів, які перебувають в інфікованій клітині культури тканини, за допомогою антитіл діагностичної імунної сироватки, специфічних імуноглобулінів або моноклональних антитіл, мічених флюорохромом, зазвичай флюоресцеином (рис. 30).

Індикація вірусів за допомогою електронно-мікроскопічного методу (ЕММ)застосовується, в основному, в наукових дослідженнях. Матеріал для ЕММ концентрують різними методами (ультрацентрифугирование, хроматографія на колонках, адсорбцией за допомогою спеціальних сорбентів або антитіл - для методу імунної електронної мікроскопії). ЕММ дозволяє виявити в ядрі або цитоплазмі клітин окремі віріони, а також їх скупчення. У практичних цілях ЕММ може бути корисний для індикації та ідентифікації вірусів з типовою морфологією (віспяні віруси, ротавіруси, коронавіруси, ВІЛ і т.д.).

Мал. 30. Реакція імунофлюоресценції (РІФ) - виявлення вірус-специфічних антигенів. х900

Індикація вірусів по утворенню бляшок - вогнищ зруйнованих вірусом моношару культури клітин під агаровим покриттям. Кількість бляшок відображає інфекційну активність вірусу.

Для постановки цієї проби вірусну суспензію в різних розведеннях вносять в культури тканини, що знаходяться в плоских судинах, після чого моношар клітин заливають гелем (шар агару або бентоніту з індикатором нейтральним червоним). Час бляшкоутворення для більшості вірусів, що володіють ЦПД, варіює від 36 до 48 год. Бляшки виглядають у вигляді нефарбованих світлих плям на рожево-червоному тлі пофарбованого моношару. У бентонітових методі моношар клітин молочного кольору, бляшки прозорі.

Індикація вірусів в курячих ембріонах.Заражені РКЕ инкубируют в термостаті при 35- 370 З протягом 48 -72 год., Після чого виробляють їх розтин, амниотическую і аллантоісную рідина відсмоктують шприцом, а оболонки і ембріон витягують і поміщають в стерильні чашки Петрі.

При репродукції деяких вірусів (натуральної віспи, осповакціни, простого герпесу) на ХАО курячих ембріонах з'являються характерні бляшки - білуваті плями діаметром 1-2 мм, кількість яких відповідає числу інфекційних частинок.

У аллантоісной і амніотичної рідини заражених ембріонів ряд вірусів (наприклад, ортоміксовіруси, параміксовіруси, аденовіруси і т.д.) може бути виявлений за допомогою реакція гемаглютинації (РГА). Принцип реакції полягає в здатності гемагглютининов поверхневі вірусних структур глікопротеідной природи цих вірусів склеювати (агглютинировать) еритроцити певних видів тварин, птахів або людини. РДА не відноситься до імунологічних реакцій, оскільки в її основі відсутня взаємодія АГ і AT.

РДА ставлять зазвичай в пробірках або в спеціальних полістиролових планшетах. Для цього готують дворазові розведення вірусосодержащего матеріалу на ФР в обсязі 0,5 мл. У всі пробірки додають 0,5 мл 1% суспензії еритроцитів. У контролі до 0,5 мл ФР додають аналогічний обсяг суспензії еритроцитів. Проби враховують через 30-60 хв інкубації при кімнатній температурі, в термостаті при 370 З або в холодильнику при 40 С. Позитивна реакція характеризується випаданням осаду еритроцитів у вигляді «парасольки» з фестончастими краями; при негативному результаті еритроцити осідають у вигляді компактного осаду ( «гудзика» - рис. 31). Гемагглютінаціонний титр (максимальне розведення вірусосодержащей рідини, що викликає аглютинацію еритроцитів - одна гемагглютинирующих одиниця вірусу, 1 ГЕ) відповідає концентрації вірусу. Аглютинацію еритроцитів можуть викликати також деякі бактерії (стафілококи, ешерихії, сальмонели, шигели, холерний вібріон Ель-Тор), що необхідно враховувати при трактуванні результатів РДА при дослідженні вірус-яке містить матеріалу, забрудненого бактеріальною мікрофлорою.

Визначення титру вірусів можна проводити також на хоріоналлантоісной оболонці. Для цього в лунки стерильних полістиролів пластин поміщають шматочки шкаралупи 11-12-денного курячого ембріона з неушкодженою ХАО, додають вірусосодержащую рідина в десятикратних розведеннях на буфері, накривають пластини фольгою і інкубують при 35-37 0 З протягом 24-72 годин. Після цього шкаралупу видаляють, додають 0,5% суспензія курячих еритроцитів і виробляють облік реакції за ефектом гемаглютинації, який свідчить про репродукції вірусу.

Мал. 31. Реакція гемаглютинації для виявлення вірусу грипу в хоріон-аллантоісной рідини курячого ембріона.

Індикація вірусів в організмі лабораторних тваринзнаходиться в залежності від вірусу і виду чутливого лабораторного тваринного, буде описана в лабораторній діагностиці конкретних вірусних інфекцій.

ідентифікація вірусів

Проводиться за допомогою таких методів.

Облік вірусіндуцірованная патологічних змін в чутливих живих системах.

Вивчення антигенних властивостей вірусів в серологічних реакціях з противірусними сироватками є основним методом ідентифікації вірусів. Для цього використовують ряд імунологічних реакцій.

реакція нейтралізації заснована на здатності антитіл нейтралізувати інфекційну активність вірусів в культурах тканини, РКЕ, чутливих лабораторних тварин. З вірус-яке містить матеріалу готують десятикратні розведення і додають до них специфічну сироватку в розведенні відповідно до титром, зазначеним на етикетці ампули. Суміші вірус-сироватка инкубируют 30 - 60 хв при 37 ° С для забезпечення зв'язування антигенів з антитілами, після чого сумішшю заражають культуру тканини, курячі ембріони або лабораторних тварин. Контролем є чутлива біосистеми, заражена вірусом без сироватки.

Реакція вважається позитивною в разі нейтралізації ЦПД в культурі клітин, а також при відсутності патологічних змін в курячих ембріонах або в організмі тварин. За результатами РН вираховується індекс нейтралізації (ІН - відношення титру вірусу в контролі до титру вірусу в досвіді). При ІН менше 10 реакція розцінюється як негативна, від 11 до 49 - сумнівна, від 50 і вище - позитивна.

РН може бути поставлена ??в найбільш чутливому варіанті - придушення вірусного бляшкоутворення під дією вирусспецифической антисироватки. Для цього до вірус-який містить матеріалу додають відповідну шуканого вірусу антисироватки і після інкубації в термостаті при 370 З протягом 30-60 хв суміш вносять у культуру чутливих клітин. Бляшкоутворення виявляють в шарі агару або бентоніту. Ідентичність вірусу антитіл сироватки проявляється придушенням бляшкоутворення.

Іншим варіантом РН є кольорова проба. Позитивний результат проби в разі відповідності вірусу противірусних антитіл проявляється блокадою репродукції вірусу, клітина при цьому залишається життєздатною, виробляючи кислі продукти метаболізму, під впливом яких колір індикатора (фенолового червоного) змінюється з червоного на жовтий. Для постановки проби в пробірки вносять по 0,25 мл робочого розведення вірусу і відповідну антисироватки. Суміш витримують при кімнатній температурі 30-60 хв, додають в кожну пробірку по 0,25 мл клітинної суспензії і закривають їх гумовими пробками. Пробірки інкубують в термостаті при 370 З 6-8 днів, результати реакції враховують по зміні кольору індикатора (червоний колір індикатора відповідає лужному характеру рН - 7,4 вказуючи на репродукцію вірусу і придушення метаболізму клітин; жовтий колір свідчить про кислому рН - нижче 7,2 в результаті нейтралізації вірусу антитілами і активному метаболізмі клітин з виробленням кислих продуктів обміну).

Реакція гальмування гемаггяютінаціі (РГГА) є одним з варіантів РН і заснована на нейтралізації гемагглютинирующих властивостей вірусів специфічними антитілами, що проявляється відсутністю аглютинації чутливих еритроцитів з формуванням на дні пробірки або лунки полістиролового планшета компактного осаду замість «парасольки». РГГА використовується як для визначення антитіл як методу серологічної діагностики, так і для ідентифікації вірусів, що володіють гемаглютиніни. Феномен РГГА проявляється в освіті компактного осаду еритроцитів замість «парасольки» гемаглютинації. Перед постановкою РГГА сироватки обробляють перйодатом калію, каоліном, бентонітом, ацетоном або іншими речовинами для видалення неспецифічних інгібіторів гемаглютинації. Після цього до дворазовим розведень сироватки додають рівну кількість віруссодержащей рідини з активністю 4 ГЕ, суміш інкубують 30-60 хв при оптимальній для даного вірусу температурі (40, 200, 370 С), а потім додають рівний об'єм 0,5-1,0% суспензії еритроцитів. Суміш знову інкубують 30-45 хв і виробляють облік результатів реакції. Титром сироватки вважають її найбільше розведення, яке викликає гальмування гемаглютинації.

Реакція гальмування гемадсорбції (РТГадс) заснована на нейтралізації ефекту адсорбції еритроцитів на поверхні клітин, інфікованих вірусами, здатними викликати гемадсорбції. Для постановки реакції по 0,2 мл специфічної сироватки, розведеної 1: 5, вносять в пробірки, інкубують 30-60 хв в термостаті при оптимальній для даного вірусу температурі, потім додають по 0,2 мл 0,5% суспензії еритроцитів. Контрольні проби містять Неімунний сироватку і еритроцити. Пробірки знову інкубують 20-30 хв, після чого виробляють облік реакції. Ідентифікація вірусу полягає в ознаці відсутності адсорбції еритроцитів на клітинах в присутності імунної сироватки при наявності гемадсорбції в контрольних пробірках.

Для антигенної ідентифікації вірусів в клітинах культур тканин використовуються також РПГ, РСК, РІФ, РОПГА ІФА, РІА зі специфічними імунними противірусними сироватками або моноклональними AT.

виявлення вірусної НК методами генодиагностики за допомогою методу молекулярної гібридизації і ПЛР;

електронно-мікроскопічне вивчення вірусів (див. вище).



Вивчення морфології вірусів по електронограмі. | Серологічний метод діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика урогенітального хламідіозу | Лабораторна діагностика бактеріального вагінозу | Лабораторна діагностика рикетсіозів | Лабораторна діагностика епідемічного висипного тифу. | Лабораторна діагностика Ку-лихоманка. | Лабораторна діагностика ерліхіозом | Лабораторна діагностика бартонеллезов | Самостійна робота студентів | Виділення вірусів на культурах клітин | Експрес-діагностика вірусних інфекцій |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати