На головну

Виділення вірусів на культурах клітин

У практиці вірусологічних лабораторій для виділення вірусів використовують первинно-тріпсінірованние, полуперевіваемие (диплоїдні) і перещеплюваних клітинні культури.

Первинно-тріпсінірованние культури клітин можна отримати з будь-яких органів і тканин людини, тварин, комах, рослин, однак найбільш часто використовуються ембріональні тканини (фібробласти курячого ембріона, людини, і ін.), що володіють підвищеною здатністю до зростання і розмноження.

Для отримання клітинної суспензії тканину відмивають від крові в розчині Хенкса, подрібнюють ножицями і кілька разів обробляють трипсином на магнітній мішалці або шляхом піпетування. Потім суспензію клітин відмивають від трипсину розчином Хенкса шляхом центрифугування при 600 об / хв протягом 5-10 хв, ресуспендіруют в живильному середовищі і визначають концентрацію клітин в камері Горяєва. Клітинну суспензію розводять живильним середовищем (звичне середовище № 199 з додаванням сироватки великої рогатої худоби) до концентрації 4-8х105 клітин в 1 мл, розливають в культуральні судини, закривають гумовими пробками. Пробірки укладають під кутом 50. Культивування клітин здійснюють в термостаті при 35-370 З 48-96 годин, протягом яких формується моношар клітин, що прикріпляється до поверхні скла (або пластика).

За допомогою версії (натрієва сіль етілендіамінотетрауксусной кислоти - ЕДТА) (рідше трипсину), клітини можна зняти з поверхні культуральної ємності і перенести їх в іншу ємність (зробити пасаж). Для цього в судини з клітинами після відсмоктування живильного середовища наливають 0,02% розчин версія або 0,25% трипсину і поміщають їх на 3-5 хв в термостат. Потім версія або трипсин видаляють, в культуральний посудину додають невелику кількість живильного середовища, в якій суспендують клітини, підраховують їх кількість, доводять їх до необхідної концентрації і розливають в нові флакони. Однак первинно-трипсінізірована клітинні культури не витримують більше 5-10 пасажів.

Перещеплюваних клітинні культури,на відміну від первинно-тріпсінірованних, переносять необмежене число пасажів, так як зазвичай їх отримують з пухлинних клітин, що мають високі здібності до зростання. Широке поширення в вірусології отримали культури клітин карциноми шийки матки (HeLa), ракової пухлини гортані (Нер-2), кісткового мозку хворого на рак легенів (Detroit-б) і т.д. Створено «банки» перевіваемих клітинних культур, в яких зберігаються клітини, заморожені рідким азотом.

Полуперевіваемие (диплоїдні) культуриотримують шляхом декількох пасажів, в результаті чого формується популяція клітин, здатних витримати до 60 пасажів, швидко розмножуватися, бути високочутливими до багатьох вірусів, зберігаючи при цьому вихідний набір хромосом.

Для культивування клітин використовуються спеціальні стерильні живильні середовища (наприклад, середовища 199, Голка, гідролізат лактальбумина і ін.) З рН 7,2-7,6, що містять повний набір амінокислот, вітаміни, чинники зростання і набір мінеральних речовин, до яких додають від 2 до 30% сироватки крові тварин (сироватка великої рогатої худоби, ембріональна теляча сироватка та ін.), а також антибіотики для запобігання зростанню бактеріальної флори. Середовища містять індикатор феноловий червоний, який має оранжево-жовтий колір при кислій реакції середовища і червоно-малиновий колір в лужному середовищі. Підтримують середовища або не містять сироватки, або містять її в невеликій кількості. Їх застосовують для збереження виросли клітин після зараження їх вірусами.

Для виділення вірусів живильне середовище з пробірок з культурою клітин видаляють, промивають моношар клітин розчином Хенкса для видалення сироваткових антитіл і інгібіторів, після чого в пробірку вносять 0,1-0,2 мл обробленого віруссодержащего матеріалу. Через 30-60 хв після зараження матеріал з пробірки видаляють, вносять 1 мл підтримуючого середовища і пробірки поміщають в термостат при 370 З для культивування.

Виділення вірусів на курячих ембріонах

Для культивування вірусів іспользуют6-15-денні курячі ембріони. Зараження здійснюють на хоріон-аллантоісную оболонку (ХАО), в жовтковий мішок, порожнина амніону і алантоїса.

При зараженні на ХАО шкаралупу обробляють спиртом, йодом і знову спиртом. Шкаралупу проколюють над повітряним мішком, а збоку в шкаралупі роблять отвір розміром 7x2 мм. Чи не пошкоджуючи оболонку під шкаралупою, короткою тонкою голкою шприца наносять на ХАО 0,1-0,2 мл вірусосодержащего матеріалу. Зараження в порожнину аллантоиса здійснюють шляхом введення досліджуваного матеріалу шприцом на глибину 10-15 мм через бічний отвір в шкаралупі.

У порожнину амніону вірусосодержащій матеріал вводять через отвір на тупому кінці яйця, при цьому голка шприца повинна бути спрямована до тіла ембріона.

Дефекти шкаралупи заливають стерильним парафіном і ембріони поміщають в термостат.



Самостійна робота студентів | Експрес-діагностика вірусних інфекцій

Серологічна діагностика сифілісу. | Лабораторна діагностика гонореї | Лабораторна діагностика урогенітального мікоплазмозу | Лабораторна діагностика урогенітального хламідіозу | Лабораторна діагностика бактеріального вагінозу | Лабораторна діагностика рикетсіозів | Лабораторна діагностика епідемічного висипного тифу. | Лабораторна діагностика Ку-лихоманка. | Лабораторна діагностика ерліхіозом | Лабораторна діагностика бартонеллезов |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати