На головну

Лабораторна діагностика холери

Холера - особливо небезпечне, карантинне інфекційне захворювання, що викликається Vibrio cholerae биоваров cholerae і eltor, що виявляється у вигляді гострого гастроентериту з вираженою інтоксикацією і зневоднюванням (ексікозом) в результаті порушення водно-електролітного обміну, cвязана з виробленням вібріонами холерного ентеротоксин (холерогена).

Основний метод лабораторної діагностики холери - бактеріологічний.

При виконанні досліджень на холеру необхідно суворо дотримуватися вимог протиепідемічного режиму. Матеріал для дослідження на холеру збирають в стерильний посуд, що не містить слідів дезінфікуючих розчинів, упаковують і доставляють в лабораторію. Банки, пробірки повинні бути герметично закриті водонепроникними пробками, які заливають парафіном, посуд обв'язують подвійним шаром вощеного паперу і обробляють дезинфікуючим розчином. У напрямку вказують прізвище, ініціали, вік хворого, його домашній і службовий адресу, діагноз, дати початку хвороби і госпіталізації, дату і годину взяття матеріалу, а також прізвище та ініціали особи, який направив аналіз. Банки і пробірки з матеріалом для дослідження перекладають ватою, поміщають, в металеву коробку, а потім в дерев'яний ящик, який пломбують, підписують «Верх, обережно» і на службовому транспорті з супроводжуючою особою пересилають в лабораторію протягом 2 годин після взяття проб.

Дослідження на холеру проводяться цілодобово в спеціальній лабораторії медичними працівниками, які пройшли підготовку з особливо-небезпечних інфекцій. Методи, що застосовуються для мікробіологічної діагностики холери, представлені в схемі 13.

мікроскопічний метод (Мікроскопія забарвлених мазків і препаратів «висячої краплі» з матеріалу від хворого) при холері в даний час не застосовується у зв'язку з низькою його інформативністю. Розроблено методи експрес-діагностики холери (РІФ).

бактеріологічний метод складається з декількох етапів.

Перший етап. Досліджуваний матеріал засівають на лужні (елективні) щільні поживні середовища (лужний агар Монсурі - МПА з тріптіказой, хлоридом натрію, таурохолатом натрію, карбонатом натрію; TCBS - тіосульфат-цитрат-бромтімол-сахарозний агар; лужної МПА) і рідкі середовища збагачення (1% лужна пептонна вода).

Другий етап проводиться через 6 -8 год від початку аналізу. Виконують пересівши з верхньої частини 1-ї середи накопичення на щільні елективні поживні середовища та на 2-ю середу накопичення. При наявності на 1-й пептонній воді ніжною блакитним плівки з неї готують мазок в забарвленні по Граму, в якому виявляють грамнегативні зігнуті у вигляді «коми» вібріони, перевіряють рухливість, ставлять ОРА з холерними сироватками О-1, О-139 і RO, а також специфічну иммунофлюоресценцию.

третій етап виконується через 12- 14 год від початку аналізу. Проводиться пересівши з верхньої частини 2-ї середовища накопичення на щільні елективні поживні середовища. Вивчають і відбирають для дослідження типові для холерного вібріона колонії на щільних середовищах, засіяних нативним матеріалом.

 Схема 13.Лабораторна діагностика холери

 Експрес-методи: пряма і непряма РІФ, РНГА з иммуноглобулинового еритроцитарних діагностикумами, реакція іммобілізації вібріонів з протихолерні сироватками з метою виявлення холерного вібріона в досліджуваному матеріалі.


Четвертий етап. (Через 18-24 год від початку аналізу). Вивчають і відбирають за допомогою стереомикроскопа типові для холерного вібріона колонії на всіх щільних середовищах. Холерний вібріон утворює прозорі, круглі, діаметром 1-2 мм, гладкі, плоскі, гомогенні, з рівними краями колонії, мають блакитний відтінок і маслянисту консистенцію. На агарі TCBS колонії холерного вібріона яскраво-жовті на зеленому тлі середовища, на середовищі Монсурі - напівпрозорі безбарвні з темним центром. Колонії перевіряють на наявність оксидази (холерні вібріони оксідазоположітельни), ставлять РА на склі з холерними сироватками О-1, О-139 і RO, а також специфічну иммунофлюоресценцию.

Позитивна РА або ІФМ в поєднанні з типовими морфологічними, тинкторіальних і культуральними властивостями виділеної культури дозволяє видати попередній позитивну відповідь.

п'ятий етап проводиться через 24 -36 годин від початку дослідження. На цьому етапі вивчають і відбирають характерні для холерного вібріона культури на середовищі Ресселя, на якій холерний вібріон розщеплює сахарозу, що супроводжується почервонінням середовища в стовпчику без утворення газу, але не ферментує лактозу (відсутність змін скошеної частини середовища). З середи Ресселя готують мазки в забарвленні по Граму з метою виявлення характерних за морфологічними властивостями вібріонів, перевіряють наявність рухливості і оксидази, ставлять РА з холерними сироватками (О-1, RO, Огава, Інаба, при негативному результаті - з сироваткою О-139) і при наявності позитивних результатів видають відповідь про виділення відповідного холерного вібріона.

Остаточну ідентифікацію оксідазопопожітельних культур проводять, використовуючи скорочену або повну схеми (табл. 15).

Таблиця 15.Диференціація холерних вібріонів

 тести  V.choleraeasiaticae  V.choleraeel-tor  НАГ
 Аглютинація О-сироваткою + + -
 Аглютинація сироватками Інаба і Огава + + -
 Лизис фагами: Холерний фаг С (фаг IV) Фаг Ель-Тор  + -  - +  + +
 Аглютинація курячих еритроцитів - + +
 Гемоліз еритроцитів барана - + +
 Зростання на середовищі з полимиксином - + +
 Гексаміновий тест - + +
 Реакція Фогес-Проскауера (освіта ацетілметілкарбінола)  -  +  +

Скорочена схема передбачає постановку розгорнутої РА з сироватками Інаба і Огава, проби з діагностичними холерними фагами, визначення ферментативної групи по Хейбергом. Повна схема додатково включає тести для диференціації биоваров холерного вібріона (класичного і Ель-Тор), зокрема, визначення гемагглютинирующих і гемолітичних властивостей, чутливості до поліміксину, здатності давати позитивну реакцію Фогес-Проскауера (освіта ацетілметілкарбінола - ацетоина з глюкози). Ацетоін визначають додаванням в культуру, вирощену на глюкозо-фосфатному бульйоні Кларка, 5% ?-нафтол та 40% -го гідроксиду калію; при струшуванні пробірок середовище забарвлюється в рожевий або рубіново-червоний колір.

Для прискореної біохімічної ідентифікації холерних вібріонів і їх диференціації від холероподібних і нехолероподобних вібріонів використовують систему індикаторних паперових дисків (СІБ), до складу якої входять тести на оксидазу, індол, ферментацію лактози, глюкози, сахарози, манози, арабінози, маніту, інозиту, аргініну, лізину та орнітину.

шостий етап (Виконується через 36-48 год від початку аналізу) - остаточна ідентифікація виділених культур, визначення їх чутливості до антибіотиків, формулювання остаточної відповіді про виділення холерного вібріона із зазначенням биовара, серогрупи (серовар) і епідемічної значущості за непрямими біологічними ознаками (гемолітичної активності, групі Хейберга і ін.). типові культури Vibrio cholerae являють собою грамнегативні зігнуті у вигляді коми або прямі поліморфні активно рухливі палички, що володіють оксидазой, розкладають глюкозу з утворенням кислоти без газу, декарбоксилируется лізин і орнітин, але не ферментують аргінін, що належать до 1-ї (рідше 2-й) групі Хейберга, агглютинируют холерними сироватками і лизирующиеся діагностичними фагами. Якщо виділена культура не аглютинується сироватками до О1 і О139, її відносять до групи НАГ-вібріонів, а при наявності відповідних сироваток визначають її приналежність до іншої серогрупи. Токсигенні штами холерних вібріонів серогрупи Про і О139 зазвичай не лизируют баранячі еритроцити, відносяться до 1-ї групи Хейберга (ферментують манозу і сахарозу, але не арабинозу), лизируются певними фагами в комплексному методі із застосуванням ХДФ.

Вірулентність холерних вібріонів визначають в спеціалізованих лабораторіях шляхом внутрикишечного зараження кроликів-шмаркачів, а також методами генодиагностики (ПЛР або ДНК-ДНК-гібридизація з метою визначення гена, відповідального за вироблення токсину).

Серодиагностикає додатковим методом лабораторної діагностики холери. Досліджують парні сироватки крові хворих, взяті з інтервалом в 6-8 днів, з метою виявлення аглютинінів за допомогою РА (діагностичний титр 1:40 і вище), антитоксинів за допомогою РНГА з еритроцитарних холерним ентеротоксіческімі діагностикумів (діагностичний титр - 1: 160) і вібріоцидних антитіл за допомогою реакції іммобілізації вібріонів (діагностичний тітр1: 1000). Враховується також наростання титру антитіл (не менше ніж в 4 рази) в процесі інфекції.

Експрес-діагностика-пряма і непряма РІФ з використанням специфічних О-холерних сироваток серогруп 01 і 0139, мічених ізотіоцианатом флюоресцеіна; РНГА зі специфічними иммуноглобулинового еритроцитарних діагностикумами. Ставлять також реакцію іммобілізації вібріонів з тими ж сироватками (2 краплі матеріалу наносять на предметне скло, в одну з них вносять краплю сироватки О1 або О139 в розведенні 1: 100, в іншу краплю ФР - контроль). Готують препарати «роздавленою» краплі, які досліджують за допомогою темнопольного, фазово-контрастного або звичайного мікроскопа з опущеним конденсором при збільшенні 400 - 600. Позитивна реакція характеризується втратою рухливості вібріонів і їх склеюванням.

Самостійна робота студентів

1. Мікроскопічний метод. Промікроскопувати і замалювати демонстраційний микропрепарат холерного вібріона V.cholerae, Пофарбований за Грамом. Холерний вібріон - грам вигнута паличка.

2. Бактеріологічний метод. Ознайомитися з основними біологічними властивостями класичного биовара холерного вібріона і биовара Ель-Тор:

· фаголізабельність. Класичний холерний вібріон лизируется фагом С і нечутливий до дії фага Ель-Тор II. Вібріон Ель-Тор лизируется фагом Ель-Тор і нечутливий до фагу С (демонстрація);

· чутливість до поліміксину. Врахувати зростання класичного холерного вібріона і вібріона зль-Тор на середовищі з додаванням поліміксину. Вібріон Ель-Тор до поліміксину не чутливий, класичний холерний вібріон - чутливий;

· гемолітичні властивості. Вібріон Ель-Тор лизирует еритроцити; класичний холерний вібріон, як правило, немає (демонстрація);

· визначення серовара холерного вібріона. Врахувати розгорнуту реакцію аглютинації c сироватками Інаба і Огава (демонстрація).

3. Вивчити біопрепарати, використовувані для діагностики, лікування і профілактики бактеріальної дизентерії та холери:

· люминесцирующий холерна сироватка для постановки реакції імунофлюоресценції з метою виявлення вібріонів;

· агглютинирующие холерні сироватки Інаба і Огава (для постановки реакції аглютинації при ідентифікації холерного вібріона);

· холерні фаги: Класичний (фаг С) і Ель-Тор. Використовуються для фагодіагностікі;

· полівалентний холерний бактеріофагдля лікування і профілактики;

· холерна вакцина.Створено 3 вакцини проти холери (убита Ель-Тор; холероген- анатоксин, збагачений О-антигеном холерного вібріона для підшкірних ін'єкцій; холероген-анатоксин, збагачений О-антигеном холерного вібріона таблетований). Використовуються для специфічної профілактики холери.



Самостійна робота студентів | Лабораторна діагностика ботулізму

Ознайомитися зі схемою лабораторної діагностики черевного тифу і паратифів | Вивчити основні етапи бактеріологічного методу дослідження черевного тифу. | Серологічний метод діагностики тифо-паратіфозних захворювань. | Лабораторна діагностика сальмонельозів | Лабораторна діагностика ешеріхіозов | Самостійна робота студентів | Лабораторна діагностика иерсиниозов | Лабораторна діагностика кампилобактериозе | Лабораторна діагностика геликобактериоза | Лабораторна діагностика бактеріальної дизентерії. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати