На головну

Г. іммуногістологіческоеультраструктурному дослідження.

Д. Імуногенетичні дослідження:HLA-типування за допомогою серологічної і молекулярно-біологічної технології, фенотипическое і генотипическое визначення аллотипи сироваткових білків, пренатальна діагностика і успадкування генетично детермінованих дефектів імунної системи.

У реальній практиці для оцінки імунного статусу виконується первинний скринінг імунної системи і постановка тестів для уточнення характеру імунних порушень. Набір методів для первинного скринінгу імунної системи (тести 1-го рівня) зазвичай включає визначення популяцій і субпопуляцій лімфоцитів по кластерам диференціювання (CD-3 - Т-лімфоцити, CD-4 - Т-хелпери, CD-8 - цитотоксичні Т-кілери / супресори, CD-16 - природні кілери, CD-19 - В-клітини і т.д.) методами цитофотометрії або иммунофлюоресцентного аналізу, визначення вмісту імуноглобулінів класів А, М, G за допомогою методу радіальної імунодифузії по Манчіні або нефелометрічеському методами, рівня циркулюючих імунних комплексів спектрофотометричним методом, показників фагоцитозу. Ці дослідження дозволяють виявити порушення в основних ланках імунітету (гуморального, клітинному, фагоцитарній). Уточнюючі методи (тести 2-го рівня), що вимагають спеціальної апаратури, реактивів та навченого персоналу, дозволяють оцінити функції клітин імунної системи, допоміжних клітин, продукцію цитокінів і т.д. Для об'єктивізації та стандартизації даних імунологічних досліджень використовується спеціальна апаратура (імуноферментні аналізатори, спектрофотометри та фотоелектроколориметри, лічильники радіоактивності, лазерні нефелометрія і проточні цитофлюориметрії, хемілюмінометре).

Переваги імунологічних методів полягають в тому, що ці методи дуже чутливі і специфічні.

Студенти знайомляться з основними методами оцінки імунного статусу організму людини в демонстрації.

1. Визначення популяцій і субпопуляцій лімфоцитів за допомогою иммунофлюоресцентного методу (демонстрація).Лімфоцити виділяють з гепаринизированной крові центрифугуванням на градієнті фіколл-верографина (щільність 1,077 г / мл). 1-0,1 млн лімфоцитів в обсязі 50 мкл вносять в центрифужні пробірки або лунки 96-ямкового круглодонних планшета. До клітинам додають 5 мкл тестованих моноклональних антитіл (CD-3 - Т-лімфоцити, CD-4 - Т-хелпери, CD-8 - цитотоксичні Т-кілери / супресори, CD-19 - В-клітини) і інкубують 30-45 хв при +40 С. Потім клітини двічі відмивають на центрифузі при 1200 об / хв протягом 5 хв, супернатант видаляють. До осадку відмитих клітин додають 50 мкл F (ab ') 2-фрагменти овечих антитіл до Ig миші в розведенні 1: 100, мічених флюоресцеином. Клітини суспендують і інкубують 30 хв при +40 С. Після цього клітини 2 рази відмивають на центрифузі, додають 50 мкл 1% параформальдегіду (або формаліну в розведенні 1:40), суспендують і аналізують на проточної цитофлюориметрії або переглядають за допомогою флуоресцентного мікроскопа, визначаючи відсоток флуоресціюючих клітин. Як негативний контролю використовують препарати, підготовлені аналогічним чином, однак замість моноклональних антитіл клітини обробляють розчином Хенкса або нормальним Ig миші.

Визначення кількості лімфоцитів різних популяцій і субпопуляцій по поверхневим маркерами проводиться також за допомогою автоматичного підрахунку клітин з використанням спеціального приладу - проточного цитофлюориметрів. Для цього зразок цільної крові інкубують з моноклональними антитілами, міченими флюоресцентним барвником, пропускають через тонку трубочку, на виході з якої формується струмінь з крапель, що містять тільки одну клітку, що проходить перед лазерним променем. При попаданні лазерного променя в клітину відбувається його відхилення, а також світіння поверхневого антигену клітини в результаті його сполуки з відповідним флюоресцирующим моноклональним антитілом. Фотопомножувач проточного цитофлюориметрів реєструє обидва сигналу, при цьому светорассеяніє дає інформацію про розміри і гранулярності клітини, а флюоресценція - про кількість пов'язаних кліткою мічених антитіл, дозволяючи судити про експресії поверхневих маркерів. При використання двох різних моноклональних антитіл, кон'югованих з різними флюорохромами (наприклад, флюоресцеіна, що дає зелене свічення, і фікоеритрину, що володіє червоним світінням), клітини оцінюються за інтенсивністю зеленого і червоного типів флюоресценції.

2. Методи оцінки функцій лімфоцитів (демонстрація). Функціональну повноцінність Т-лімфоцитів побічно оцінюють за допомогою шкірних проб, що відображають інтенсивність реакцій ГЗТ щодо поширених мікробних алергенів (кандидозного, стрептококових, туберкуліну і т.д.). Алерген вводять під шкіру і через 48 год вимірюють діаметр інфільтрату - ущільнення, що відображає інтенсивність реакції ГЗТ.

Однією з функцій лімфоцитів є їх проліферація у відповідь на дію антигенів - індукторів проліферації - так званих неспецифічних поліклональних митогенов. Для Т-лімфоцитів поширеним поліклональними митогенами є фитогемагглютинин, отриманий з бобів рослин), для В-лімфоцитів - компоненти бактерій (ліпополісахарид клітинної стінки грамнегативних бактерій, А-протеїн стафілокока і т.д.). Для кількісної оцінки проліферації клітин зазвичай досліджують включення радіоактивної мітки (Н3-тимідину) в ДНК клітин як показник їх проліферації. Цей тест проліферативної активності лімфоцитів називається реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ).

Інший підхід до оцінки функцій Т-лімфоцитів полягає в вимірі їх здатності продукувати цитокіни, що з'являються при активації Т-лімфоцитів антигенами (митогенами). Визначення типів цитокінів та їх кількості в культуральному середовищі Т-лімфоцитів дозволяє оцінити функціональну активність клітин. Кількість цитокінів визначають по їх біологічної активності або за допомогою ІФА.

Функції В-лімфоцитів побічно оцінюють за рівнями імуноглобулінів, ізогемагглютінінов і нормальних антибактеріальних антитіл в сироватці крові.

Реакція гальмування міграції лейкоцитів (РТМЛ - демонстрація). Реакція заснована на здатності лімфоцитів після повторного контакту з антигеном, до якого вони були раніше сенсибілізовані, продукувати лімфокіни, що впливають на міграцію гранулоцитів, моноцитів, макрофагів. РТМЛ периферичної крові в присутності причинного антигену дозволяє виявити специфічну сенсибілізацію Т-лімфоцитів. РТМЛ ставлять в капілярах або під шаром агарози. Проводять інкубацію лейкоцитів крові в присутності і під час відсутності причинного мікробного антигену, після чого вимірюють зони міграції (у відсотках) в присутності антигену в порівнянні з контролем, прийнятим за 100%. У разі виявлення сенсибілізації до антигену спостерігається гальмування міграції лейкоцитів (індекс нижче 100%).

2. Визначення змісту імуноглобулінів в сироватці крові людини методом радіальної імунодифузії за Манчіні (демонстрація). У 3 пробірки з розплавленим і охолодженим до 500 З агаром вносять відповідно сироватки проти імуноглобулінів людини класів М, А, G. Вміст пробірок розливають на 3 скляних або пластикових пластини. Після застигання агару в ньому на відстані 1 см один від одного вирізують лунки. В лунки вносять досліджувані і еталонні сироватки з відомим вмістом імуноглобулінів. Імуноглобуліни досліджуваних сироваток дифундують в агар і утворюють зону преципітації навколо лунки, взаємодіючи з антитілами, що знаходяться в агарі. Вимірюють діаметр кільця преципітації досліджуваної сироватки і порівнюють з діаметром кільця преципітації еталонної сироватки. Використовуючи калібрувальну криву або спеціальну комп'ютерну програму, визначають рівень імуноглобулінів в сироватці в г / л.

3. Оцінка фагоцитарної ланки імунітету (демонстрація).Цитратну кров або лейкоцитарную суспензія инкубируют з бактеріями або іншими об'єктами (частки латексу, дріжджі і т.д.) протягом 30 хвилин, після чого готують мазок, фарбують за методом Романовського-Гімза і микроскопируют. Підраховують 100 клітин для визначення відсотка фагоцитуючих клітин (в нормі 40-80%) і кількості бактерій захоплених 1 фагоцитуючої кліткою (в нормі - 1-5).

Крім того оцінюють інтенсивність окисного вибуху в фагоцитах (непрямий показник бактерицидності) по здатності відновлювати жовтий барвник нітросинім тетразолієм (НСТ) з формуванням в цитоплазмі фагоцитів грудочок темно-синього формазану. Чим активніше окислювальний вибух в фагоцитах, тим більша частка клітин містить осад формазану. Після підрахунку клітин частка формазану-позитивних виражається у відсотках. При інкубації лейкоцитів здорових осіб лише з барвником без індуктора окисного вибуху частка формазану-позитивних клітин не перевищує 1-2%. Інкубація лейкоцитів здорових осіб з індуктором окисного вибуху (об'єкти фагоцитозу, бактеріальні полісахариди) призводить до окислювального вибуху всіх 100% фагоцитів і накопиченням осаду формазану. Зниження частки формазану-позитивних клітин свідчить про дефектність киснево механізму бактерицидності фагоцитів.

2. Титрування комплементу сироватки крові (демонстрація). Метод заснований на феномені комплементзавісімого лізису навантажених антитілами еритроцитів барана. За одиницю активності комплементу приймається таке його кількість, яке викликає гемоліз 50% сенсибілізованих еритроцитів (СН50).

У пробірку з сироваткою крові в розведенні 1:10 додають гемолітичну систему (суміш еритроцитів барана з гемолітичної сироваткою кролика), інкубують 45 хвилин при 370 З, що збереглися еритроцити осаджують центрифугуванням. Інтенсивність гемолізу реєструють за допомогою спектрофотометра або фотоелектроколориметра. У здорових людей титр комплементу становить 40-80 СН50 на 1 мл.

Титрування комплементу по 50% гемолізу не дозволяє судити про стан окремих компонентів системи комплементу. В даний час випускаються імуноферментні тест-системи для визначення окремих компонентів системи комплементу.

В останні роки налагоджено випуск імуноферментних систем для визначення різних цитокінів. Дослідження рівня цитокінів при різних патологічних станах дає цінну інформацію для діагностики ряду хвороб і призначення обгрунтованого лікування.

Оцінка імунного статусу організму людини при різних патологічних станах має важливе практичне значення для діагностики, лікування, прогнозування, оцінки ефективності проведеної терапії при багатьох захворюваннях. Показники імунограми здорової людини представлені в таблиці 12.

Таблиця 12

Показники імунограми здорової людини

 показники  норма  показники  норма
 Лейкоцити кл / л  3500-8500  CD-11B %%  15-27
 лімфоцити %%  25-35  CD-11B кл / л  300-540
 Лімфоцити кл / л  1600-2400  CD-16 (NК-клітини) %%  9-16
 моноцити %%  3-10  CD-16 (NК-клітини) кл / л  200-400
 Моноцити кл / л  90-300  СD-19 (В-лімфоцити) %%  10-16
 Нейтрофіли с / я %%  50-65  СD-19 (В-лімфоцити) кл / л  100-400
 Нейтрофіли с / я кл / л  2000-4000  CD-25 %% (рецептор до ІЛ-2)
 Паличкоядерні. %%  1-4  CD-25 кл / л (рецептор до ІЛ-2)
 Паличкоядерні. кл / л  40-300  СD НLА-DR %%  7-18
 юні %%    СD НLА-DR кл / л  300-600
 Юні кл / л    CD-95 %% (рецептор апоптозу)  41-63
 еозинофіли %%  1-4  CD-95 кл / л  820-1260
 Еозинофіли кл / л  20-300  ЦВК усл.ед.  18-45
 базофіли %%  0-1  ШОЕ  1-15
 Базофіли кл / л  0-70  IgG г / л  9,0-16,0 г / л
 СD-3 (Т-лімфоцити) %%  50-76  IgM г / л  0,7-1,5 г / л
 СD-3 (Т-лімфоцити) кл / л  1000-2200  IgА г / л  1,0-2,5 г / л
 СD-4 (Т-хелпери) %%  30-46  IgЕ г / л  0-150МЕ / мл
 СD-4 (Т-хелпери) кл / л  500-1000  Фагоцитарна активність %%  50-74
 СD-8 (Т-кілери / супресори) %%  26-40  фагоцитарний показник  5-9
 СD-8 (Т-кілери / супресори) кл / л  400-800  ХЛ фагоцитів спонтанна  1,0-1,8
 СD-4 / СD-8 (ІРІ)  1,0-1,6  ХЛ стимульована  3-12

Примітка: ХЛ- хемілюмінесценція нейтрофілів (спонтанна, стимульована)



Самостійна робота студентів | Вакцини і анатоксини

Самостійна робота студентів | Вивчення характеру зростання S (E.coli) і R (B. cereus) форм бактерій на щільному і рідкої поживних середовищах (демонстрація). | педіатричні аспекти | Самостійна робота студентів | Самостійна робота студентів | Педіатричні аспекти теми | Освоєння біологічного методу діагностики. | Вивчення деяких факторів патогенності бактерій. | Постановка і облік розгорнутої реакції аглютинації з сироваткою крові хворого при підозрі на бруцельоз (I4 день захворювання). | Самостійна робота студентів |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати