На головну

електрофорез білків

  1. I. Хімічні властивості білків
  2. II. Методи кількісного визначення білків
  3. Гемоглобіновая, білкова

Метод електрофорезу є одним з найпоширеніших, потужних і доступних методів дослідження білків. Цей метод широко застосовується як в наукових дослідженнях, так і при експертизі якості продуктів харчування і медичних препаратах, а також в клінічних лабораторіях.

За допомогою методу електрофорезу виробляють:

1) аналіз складних сумішей білків (в генетичних дослідженнях, при виділенні і біотехнологічної напрацювання білків)

2) виявлення певного білка (при проведенні експертизи, контроль біотехнологічних процесів, клінічних аналізах)

3) визначення молекулярної маси білків (в фундаментальних дослідженнях)

4) дослідження структури білків (аналіз розташування в біологічних мембранах, взаємодії з іншими білками, вивчення питань фолдинга білків)

В основі методу електрофорезу лежить той факт, що молекули білків у водних розчинах заряджені, тобто фактично є іони. Як будь-яка частка, що несе електричний заряд, молекули білків здатні переміщатися в електричному полі. Таким чином, якщо до розчину білка прикласти електричне поле (опустити в нього електроди і подати постійну напругу), то все молекули білків почнуть рухатися. Внаслідок різниці в амінокислотним складом різні білки заряджені різнойменно - позитивно або негативно. З цієї причини різні білки будуть рухатися в різних напрямках: позитивно заряджені - до катода (негативний електрод), негативно заряджені - до анода (позитивний електрод). Крім того, величина заряду білкових молекул також неоднакова - молекули одних білків заряджені сильніше, інших - менше. Білки, молекули яких мають більший заряд, будуть рухатися швидше, ніж ті, що несуть менший заряд. Також на поділ білків методом електрофорезу великий вплив робить розмір молекул білків. Більші білки рухаються повільніше, ніж білки невеликих розмірів, внаслідок того, що вода чинить опір переміщенню (є вузький середовищем).

У зв'язку з тим, що амінокислотний склад білків і їх маса розрізняються досить сильно, електрофорез дозволять аналізувати дуже складні суміші білків. Для вирішення різних дослідницьких завдань було запропоновано безліч різних варіантів електрофорезу.

4.9 Електрофорез по Леммлі

Електрофорез по Леммлі - один з методів електрофорезу в гелі, застосовуваний для аналізу складних білкових сумішей. Даний метод дозволяє розділяти білки з їх молекулярній масі. Також електрофорез по Леммлі може бути використаний для визначення молекулярної маси білків.

Білки, що підлягають аналізу методом електрофорезу по Леммлі, попередньо обробляють концентрованим 5% -ним розчином додецилсульфату натрію (рис. 15) при 100С в присутності ?-меркаптоетанол. При цьому білкові молекули набувають негативний заряд, що значно перевищує її власний. При подальшому поділі в поліакриламідному гелі білкові зони розподіляються на електрофор грамах у відповідність з логарифмом їх молекулярної маси

Мал. 15. додецилсульфат-аніон, присутній в розчинах додецилсульфату натрію

Як гелю для електрофорезу по Леммлі використовуються поліакриламідні гелі, що дозволяє досягти високої роздільної здатності даного методу. Поліакріламідний гель являє собою продукт кополімеризації акриламіду (рис. 16)

Мал. 16. Акріламід

і зшиває агента N, N- метіленбісакріламда (рис. 17)

Мал. 17. N, N- метіленбісакріламід

В результаті процесу кополімеризації утворюється міцний, пружний, термостабільний гель, що володіє високими механічними властивостями і хімічною інертністю. Просторова структура гелю є сіткою зі структурою (рис. 18). Пористість гелю залежить від концентрації мономерів і її можна варіювати в значних межах від 40 до 0,1 нм (2-30% мономерів). Регулярно чергуються амідні групи роблять гель гідрофільних. Відсутність іонізуючого груп істотно знижує ендосмосом, а також взаємодія білків із структурою гелю.

Мал. 18. Структура поліакріламідного гелю

В якості каталізатора реакції кополімеризації застосовують джерело вільних радикалів - персульфат амонію або калію. Каталізатором реакції виступає N, N, N, N-тетраметілетілендіамін.

Полімеризацію гелю ведуть в скляних трубочках довжиною 70-100 мм з внутрішнім діаметром 5 мм або плоских пластинах. Для цього в одній трубці послідовно полимеризуют два гелю для електрофорезу, розташовуючи їх один під іншим: 1) верхній - великопористий гель в якому зразок стискається в вузьку смугу (концентрує гель), 2) нижній - дрібнопористий гель, в якому відбувається поділ білкової суміші на компоненти під дією ефекту «молекулярного сита».

Для проведення електрофорезу гелів стовпчиками з'єднують розташовані один над одним резервуари з буферами, в які введені електроди і подають на електроди напруга 40-800 вольт.

Як звіт про виконану роботу:

1. Замалюйте структурні формули додецилсульфата натрію, акриламіду, N, N- метіленбісакріламіда, структуру поліакріламідного гелю

2. Замалюйте розташування білкових смуг, отриманих в результаті електрофорезу по Леммлі, зробіть висновок про склад виданого вам розчину білка (кількість компонентів, приблизна частка головних компонентів і їх число, приблизна частка мінорних компонентів і їх число)

Хід роботи:

Підготувати пробу білка для електрофорезу. Для цього в Еппендорф об'ємом 2 мл помістити 100 мкл розчину білка з концентрацією 4 мг / мл і додати 100 мкл буфера проби. Вміст перемішати інжектування.

Помістити пробірки в поплавок і помістити у водяну баню. Нагріти до кипіння і кип'ятити 5 хвилин, потім охолодити

Розчинити навішення персульфата калію в 2,5 мл ДВ. Для цього внести автоматичною піпеткою 2,5 мл ДВ і перемішувати інжектування до повного розчинення солі (розчинення йде повільно)

Зібрати трубку для електрофорезу і помістити її вертикально в штатив

У центрифужной пробірці приготувати суміш для розділяє гелю

ДВ 1080 мкл

Розчин мономерів 1250 мкл

1,5 М Тріс-HCl рН8,8 167 мкл

розчин ДСН 10% -ний 25 мкл

розчин ТЕМЕД 1: 5 25мкл

р-ра персульфат калію 20 мкл

Після внесення розчину персульфата калію, вміст пробірки перемішують інжектування і негайно вносять в трубку для електрофорезу

Суміш для розділяє гелю вносять в трубку для електрофорезу трьома порціями по 800 мкл. Розчин вносять обережно, по стінці трубки не збиваючи його.

Після внесення в трубку розчину для розділяє гелю поверх нього обережно нашарувати приблизно 100 мкл ДВ

Залишити трубку на 15-20 хв для полімеризації. Про закінчення полімеризації свідчить поява чіткої межі між розчином для розділяє гелю і нашарувань водою.

Після закінчення полімеризації злити воду з гелю, залишки рідини прибрати з поверхні гелю фільтрувальної папером, скрученої в трубочку

У центрифужной пробірці приготувати суміш для концентрує гелю

ДВ +1445 мкл

Розчин мономерів 340 мкл

0,5 М Тріс-HCl рН6,8 125 мкл

розчин ДСН 10% -ний 20 мкл

розчин ТЕМЕД 1: 5 50 мкл

р-ра персульфат калію 20 мкл

Після внесення розчину персульфата калію, вміст пробірки перемішують інжектування і негайно вносять в трубку для електрофорезу

250 мкл суміші для концентрує гелю вносять в трубку для електрофорезу. Розчин вносять обережно, по стінці трубки не збиваючи його.

Після внесення в трубку розчину для розділяє гелю поверх нього обережно нашарувати приблизно 100 мкл ДВ

Залишити трубку на 5-10 хв для полімеризації. Про закінчення полімеризації свідчить поява чіткої межі між розчином для розділяє гелю і нашарувань водою.

Після закінчення полімеризації гелю з трубки знімаю заглушку і встановлюють трубки для електрофорезу в катодний камеру приладу (рис. 19) так, щоб кордон концентрує і розділяє гелю була видна у верхній (катодного камері)

Мал. 19. Прилад для вертикального гель-електрофорезу в трубках.

1 верхня, анодная камера, 2 - нижня, катодний камера, 3 - трубки з гелем для електрофорезу, 4 - позитивний електрод, анод, 5 - анод, катод.

Приготувати 1,2 л анодного буфера. Для цього розбавити вихідний анодний буфер в 4 рази ДВ за допомогою мірного циліндра об'ємом 1 л.

Заповнити анодний камеру анодним буфером. Помістити в камеру анод (червоний провід). Помістити катодний камеру над анодної і зафіксувати її гвинтами. При цьому нижні кінці трубок повинні бути занурені в буфер в нижній камері (анодний буфер).

Приготувати 1,2 л катодного буфера. Для цього розбавити вихідний катодний буфер в 4 рази ДВ за допомогою мірного циліндра об'ємом 1 л. заповнити катодний камеру катодних буфером. При цьому кінці трубок повинні опинитися під шаром електродного буфера.

Промити нижні і верхні кінці трубок для видалення залишків розчинів для полімеризації гелів і бульбашок повітря.

60 мкл підготовленого розчину білка в Еппендорфі змішують зі 180 мкл ДВ і перемішують інжектування. 200 мкл отриманої суміші вносять в трубки для електрофорезу, обережно нашаровуючись на поверхню гелю.

Включають напругу 250 вольт, через 10 хвилин піднімають його до 300 вольт, а ще через 10 хвилин до 400.

Приблизно через 40 хвилин, коли фронт бромфенолового синього пройде практично всю трубку, напруга вимикають, слухають електрод з катодного камери. Розбирають прилад і виливають катодний буфер. Потім виймають трубки для електрофорезу і виштовхують стовпчики гелю з трубок скляним штоком. Концентрує гель відрізають скальпелем.

Розділяє гель забарвлюють колоїдним розчином Кумассі діамантового блакитного протягом 20 хв на киплячій водяній бані. Потім переносять пофарбований гель в киплячу воду і відмивають до прояву білкових смуг.

Питання для самопідготовки

У чому практичне значення електрофорезу?

Що можна встановити за допомогою електрофорезу?

У чому суть методу електрофорезу?

Від яких параметрів залежить швидкість переміщення молекули білка?

У чому особливість електрофорезу по Леммлі?

За яким параметром поділяються білки при проведенні електрофорезу по Леммлі?


Питання до колоквіуму за темою «Білки»

1. Функції білків

2. Елементний склад білків

3. Які органічні сполуки називають амінокислотами, хімічні властивості амінокислот

4. Кислотно-основні властивості амінокислот (амфотерность амінокислот, біполярні іони, криві титрування)

5. Класифікація амінокислот (біологічна, фізико-хімічна, хімічна)

6. Фізичні властивості амінокислот, стереоконфігурація амінокислот

7. Специфічні реакції на амінокислоти

8. Зв'язок амінокислот в білках, пептидний зв'язок - структура і властивості

9. Біуретова реакція. Визначення білка біуретовим методом.

10. Амінокислотний аналіз. Методи хроматографії амінокислот.

11. Нінгідринова реакція. практичне значення

12. Первинна структура білка. Методи встановлення первинної структури білка

13. Вторинна структура білка, ?-спіраль, ?-шар

14. Третинна і четвертинна структура білка

15. Хімічні зв'язку, стабілізуючі структуру білка (первинну, вторинну, третинну і четвертинних)

16. Розчинність і осадження білків. Сили утримують білок в розчині, умови осадження білків.

17. Реакції оборотного і необоротного осадження білків, їх практичне значення.

18. Білки як носії електричних зарядів, кислотно-основні властивості білків, ізоелектрична точка

19. Діаліз. Електрофорез. ізоелектричного фокусування

20. Класифікація білків

21. Виділення білків з тканин. Методи виділення та очищення білків


Використана література

The protein protocols handbook, 2nd edition - edited by Walker J.M. - Humana press, 2002

Петров К. П. - Методи біохімії рослинних продуктів - Київ: Вища школа, 1978.

Шапіро Д. К. - Практикум з біологічної хімії, 2-е вид. перераб. і доп. - Мінськ: Вища школа, 1976

Практикум з біохімії: навчальний посібник, 2-е вид. пререаб і доп. - Під ред. Северина - М .: МГУ, 1989

Р. Доусон, Д. Еліот та ін. - Довідник біохіміка, пров. з англ. - М .: Світ, 1991

Скурихин І. М., Нечаєв А. П. - Все про їжу з точки зору хіміка: довідкове видання. - М .: вища школа, 1991

Стьопін Б. Д. - Техніка лабораторного експерименту в хімії: навч пособи для вузів - М .: Хімія, 1999

Хімічна енциклопедія ТТ.1-5., Гл. ред. Кнунянц І. Л. - М .: Радянська енциклопедія, 1988-1998




розчинність білків | Додаток.

I. Хімічні властивості білків | Робота з автоматичною піпеткою | II. Методи кількісного визначення білків | Робота зі спектрофотометром | III Методи аналізу амінокислот | колоїдні властивості |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати