На головну

розчинність білків

  1. I. Хімічні властивості білків
  2. II. Методи кількісного визначення білків
  3. Висока розчинність в напівпровіднику при температурі дифузії

Існує два типи білків - розчинні і нерозчинні у воді або водних розчинах солей. При певних умовах розчинні білки можуть формувати опади, а нерозчинні - утворювати розчини. Процеси розчинення і осадження білків використовуються у виробництві лікарських препаратів (антитіл і сироваток), реактивів для діагностики і досліджень, харчових і кормових добавок, біологічно активних добавок до їжі, деяких сортів клею і фарб. Деякі реакції осадження білків лежать в основі процесів фарбування тканин і дублення шкіри. Таким чином реакції осадження білків мають велике технологічне значення. Також осадження і розчинення білків часто зустрічається в практиці роботи науково-дослідних лабораторій і використовується для очищення білків при їх виділенні і аналізі.

Більшість білків добре розчиняється в воді, що обумовлено наявністю на «поверхні» їх молекул полярних і заряджених груп, здатних зв'язуватися з молекулами води (тобто гідратованих). Гідратація молекул білка - обов'язкова умова їх розчинення. Бічні радикали деяких амінокислот, здатні диссоциировать в воді і формувати іонні групи, що несуть заряд. Заряджені групи білка активно взаємодіють з молекулами води за рахунок іон-дипольних взаємодій. Бічні радикали інших амінокислот не заряджені, але сільнополярних (-NH2-група аспарагина і глутаміну, - ОН-група серину і треоніну) утворюють з молекулами води водневі зв'язки.

Розчинність білків сильно залежить від умов середовища. Розчинні білки при певних умовах можуть втрачати розчинність і випадати в осад. Осадження білків використовують для їх виділення і фракціонування, а також отримання безбілкових фільтратів в дослідницькій і виробничій практиці.

Щоб домогтися випадання білка в осад потрібно або знизити заряд білкових молекул, або зруйнувати їх гідрадну оболонку (зневоднені).

Реакції осадження білків ділять на дві групи:

1) незворотні реакції осадження, при яких білки зазнають глибокі зміни і не можуть бути знову розчинені в первісному розчиннику.

2) оборотні реакції осадження, при яких обложений білок може бути знову розчинений

У першому випадку настає денатурація, тобто зміна нативной конформації білка супроводжується втратою біологічної активності. До необоротних реакцій відноситься осадження білка солями важких металів, алкалоїдними реактивами, мінеральними і органічними кислотами і осадження при нагріванні. У другому випадку обложені білки не піддаються глибоких змін, молекула білка при цьому зберігає свої початкові, нативні, включаючи біологічні, властивості і не піддається помітною денатурації. До оборотним реакцій осадження слід віднести осадження білків органічними розчинниками (спиртом і ацетоном) і висолювання білків нейтральними солями.

Як звіт про виконану роботу (роботи 4.2 - 4.8) заповніть таблицю

 білок  Використаний осадитель і його концентрація  Осад (є / немає)
 альбумін  дистильована вода  
 глобулін  
 альбумін  5% NaCl  
 глобулін  
 альбумін  напівнасичення розчин (NH4)2SO4  
 глобулін  
 альбумін  насичений розчин (NH4)2SO4  
 яєчний білок (1%)  нагрівання  нейтральне середовище  
 слабокисла середу  
 сильнокислим середовищем  
 сильнокислим середовищем + електроліт  
 лужне середовище  
 етанол  
 етанол + NaCl  
H2SO4 конц.  подслоеніе  
 змішування  
 НCl конц.  подслоеніе  
 змішування  
 HNO3  подслоеніе  
 змішування  
 трихлороцтової кислота  
 сульфосаліцилова кислота  
 пікринова кислота  
 танін  
 залізосиньородистим калій  
 сульфат міді  
 ацетат свинцю  
         

4.2. Вплив нейтральних солей на розчинність білків

Нейтральні солі (наприклад, Na2SO4, NaCl, (NH4)2SO4) В невеликих концентраціях підвищують розчинність білків у воді внаслідок того, що вони збільшують ступінь дисоціації іонізованих груп білка і сприяють його гідратації.

Високі концентрації нейтральних солей, навпаки, беруть в облогу (висолюють) білки з водних розчинів. При розчиненні нейтральних солей їх іони конкурують з молекулами білка за воду, необхідну для формування гідратних оболонок. Висока концентрація іонів нейтральних солей «відтягує до себе» молекули води від білка, позбавляючи його гідратної оболонки. Висолювання білків є оборотним процесом. Якщо видалити сіль (при розведенні водою, шляхом діалізу або іншим способом) білок знову гідратіруется. Висолювання часто використовується в науково-дослідній роботі при очищенні білків або в виробництві медичних препаратів імуноглобулінів з сироватки крові.

Хід роботи

В пробірку №1 вносять 0,2 мл нерозведеного яєчного білка і 2 мл води, вміст перемішують. При цьому яєчний альбумін розчиняється, а яєчний глобулін випадає у вигляді невеликого осаду (або суміш мутніє).

В пробірку №2 вносять 0,2 мл нерозведеного яєчного білка і 2 мл 5% -ного розчину хлориду натрію. У слабкому сольовому розчині розчиняються і альбуміни і глобуліни.

В пробірку №3 наливають 2 мл яєчного білка, додають рівний об'єм насиченого розчину сульфату амонію, вміст перемішують (отримують напівнасичення розчин сульфату амонію). При цьому випадає осад яєчного глобуліну. Через 5 хв осад відфільтровують. У фільтраті залишається інший білок - яєчний альбумін. Для фільтрування розчину білка використовують складчастий фільтр з бистрофільтрующей паперу, який попередньо змочують невеликою кількістю дистильованої води.

Для висолювання альбуміну до фільтрату додають подрібнений порошок сульфату амонію до повного насичення, тобто поки не припиниться розчинення солі. Випав осад альбуміну відфільтровують через новий фільтр і з фільтратом проробляють біуретову реакцію. Негативна биуретовая реакція вказує на відсутність білка

4.3 Осадження при нагріванні

При температурі вище 50 ° С майже всі білки зазнають теплову денатурацію. При цьому, на випадання білків в осад значний вплив мають присутність електролітів і рН середовища. Найбільш повне і швидке осадження відбувається в ізоелектричної точці, тобто при такій величині рН, коли колоїдні частинки білка є найменш стійкими. Тому для повного осадження білка при нагріванні слід створити реакцію середовища, відповідну його ізоелектричної точці (білки, що володіють кислими властивостями, осаджують в слабокислою середовищі, білки, що володіють лужними властивостями - в слабощелочной).

У сильнокислому (за винятком азотної, трихлороцтової і сульфосалициловой кислот) і сільнощелочних розчинах денатурований при нагріванні білок не випадає в осад, так як частинки білка перезаряджаються (або відбувається посилення наявного заряду). Вони несуть в першому випадку позитивний, у другому випадку - негативний заряд, що підвищує їх стійкість в розчині в результаті електростатичних сил відштовхування. Однак нагрівання в сильнокислому розчинах в присутність достатньої кількості будь-якої нейтральної солі білки можуть випадати в осад.

Хід роботи.

У 5 пронумерованих пробірок наливають по 1 мл 1% -ного розчину яєчного білка.

Вміст першої пробірки нагрівають на спиртівці. Рідина мутніє, але так як частинки денатурованого білка несуть заряд, вони утримуються в підвішеному стані (яєчний альбумін є кислим білком і в нейтральному середовищі заряджається негативно).

В пробірку 2 додають 500 мкл 1% -ного розчину оцтової кислоти і нагрівають. Випадає осад внаслідок того, що білок втрачає заряд і наближається до ізоелектричної стану.

В пробірку 3 додають 100 мкл 10% -ного розчину оцтової кислоти і вміст нагрівають. Осад білка не утворюється, навіть при кип'ятінні, так як в сильнокислой середовищі частинки білка перезаряджаються, набуваючи позитивний заряд.

У 4 пробірку додають 100 мкл 10% -ного розчину оцтової кислоти і 100 мкл насиченого розчину хлориду натрію. Утворюється осад білка внаслідок адсорбції іонів хлорид-іона (освіта подвійного електричного шару) і нейтралізації позитивного заряду на частинках білка.

в пробірку 5 додають 100 мкл 10% -ного розчину гідроксиду натрію і нагрівають. Осад білка не утворюється навіть при кип'ятінні, тому що в лужному середовищі негативний заряд на частинки білка посилюється.

Результати цієї і наступних робіт розділу «Осадження білків» вносять в таблицю 7.

4.4 Осадження органічними розчинниками

Білки нерозчинні у багатьох полярних органічних розчинниках (спирт, ацетон, та ін.). Однак їх осадження відбувається тільки з нейтральних і слабокислих розчинів і особливо повно в присутність електролітів. Органічні розчинники дегідратірующая частки білка (руйнують водну оболонку) і тим самим знижують їх стійкість в розчині.

Короткочасний вплив етилового спирту або ацетону чи не порушує природної структури білка, тоді як тривалий вплив призводить до денатурації.

Хід роботи:

У пробірку наливають 0,5 мл 1% -ного розчину яєчного білка і 2 мл спирту або ацетону. Відзначте наявність / відсутність осаду

Потім додати 0,2 мл насиченого розчину хлориду натрію. Відзначте наявність / відсутність осаду

4.5 Осадження концентрованими мінеральними кислотами

Осадження білка під дією мінеральних кислот відбувається не тільки внаслідок дегідратації і нейтралізації заряду білкових частинок, але і в результаті утворення солей, денатурації. В надлишку сірчаної або соляної кислот, а також при їх тривалому впливі випав осад денатурованого білка розчиняється, мабуть, за рахунок перезарядки білка і часткового гідролізу. В надлишку азотної кислоти цього розчинення не відбувається (точний механізм цього явища не встановлено, можливо, що іон NO3- заважає перезарядки білкової молекули).

Хід роботи.

У три пробірки наливають по 15-20 крапель концентрованої соляної, сірчаної та азотної кислот. Потім нахиливши пробірку під кутом 45 °, обережно по стінці пробірки, щоб рідини не змішувалися (подслоеніе) налити 1 мл 1% -ного розчину білка. На кордоні двох шарів рідини з'являється осад білка у вигляді тонкої плівки. Обережно струшуючи пробірки, виявляють розчинення осаду білка в разі осадження соляної і сірчаної кислотами, в пробірці з азотною кислотою білок не розчиняється

4.6 Осадження органічними кислотами

Білки з розчинів можуть осідати органічними кислотами, проте різні органічні кислоти неоднаково діють на білок. Трихлоруксусная (CCl3COOH) і сульфосаліцилова кислоти (рис. 13) є чутливими і специфічними реактивами, що викликають осадження білків, і тому широко використовуються для доказу наявності білка в розчині. Сульфосаліцилова кислота осаджує не тільки білки, а й високомолекулярні поліпептиди.

Мал. 13. сульфосаліцилову кислота

Хід роботи.

У дві пробірки наливають по 0,5 мл 1% -ного розчину білка, в одну пробірку додають 200 мкл 10% -ного розчину сульфосалициловой, в іншу 200 мкл 10% -ного розчину трихлороцтової кислоти. Відзначте наявність / відсутність осаду.

4.7 Осадження алкалоїдними реактивами

Осадження «алкалоїдними» реактивами обумовлено наявністю в білку азотистих гетероциклічних угруповань аналогічно тим, які знаходяться в молекулах алкалоїдів. (Алкалоїди - низькомолекулярні азотовмісні речовини основного характеру, що володіють високою біологічною активністю). Більш повне осадження спостерігається при негативному заряді білкової молекули (наприклад, при достатньому підкисленні), що полегшує взаємодію білка з негативно зарядженими іонами осадителя.

Хід роботи.

У три пробірки наливають по 1 мл 1% -ного розчину яєчного білка, і по 200 мкл 1% -ного розчину оцтової кислоти. Потім в першу пробірку доливають 200 мкл 10% -ного розчину пікринової кислоти (рис. 14), в другу 200 мкл насиченого розчину таніну, в третю - 200 мкл 5% -ного розчину железосинеродистого калію. Відзначають утворення осаду.

Мал. 14. Пікринова кислота

4.8 Осадження солями важких металів

При дії солей важких металів на розчини білка відбувається денатурація білкової молекули. Осадження денатурованого білка обумовлено адсорбцією важкого металу на поверхні білкової молекули і утворенням нерозчинних комплексів. При осадженні білків деякими солями важких металів, наприклад, оцтовокислим свинцем і сульфатом міді, надлишок цих солей веде до розчинення (пептізаціі) спочатку утвореного осаду, що пов'язано з адсорбцією важкого металу на поверхні колоїдних частинок і появою позитивного заряду на молекулі білка. При надлишку солей срібла і ртуті пептизація осаду не відбувається.

Хід роботи

У дві пробірки вносять по 0,5 мл 1% -ного розчину яєчного білка і по 100 мкл: в першу пробірку - 7% -ного розчину сульфату міді, в другу 5% -ного розчину оцтовокислого свинцю. У всіх пробірках утворюється осад.

В першу пробірку додають ще 0,5-1 мл 7% -ного розчину сульфату міді, при цьому спостерігається розчинення осаду.

Питання для самопідготовки

У чому суть процесу діалізу?

Яке практичне значення діалізу?

Яке практичне значення процесів осадження розчинення білків?

Які дві умови необхідно виконати для осадження білка?

Що таке оборотні і необоротні реакції осадження?

Що відбувається при незворотному осадженні білка?

Які оборотні реакції осадження ви знаєте?

Які незворотні реакції осадження вам відомі?

Що відбувається з молекулами білків при висолювання і осадженні органічними розчинниками?

 



колоїдні властивості | електрофорез білків

I. Хімічні властивості білків | Робота з автоматичною піпеткою | II. Методи кількісного визначення білків | Робота зі спектрофотометром | III Методи аналізу амінокислот | Додаток. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати