Головна

III Методи аналізу амінокислот

  1. D графіка. Методи 3D моделювання, достоїнства і недоліки.
  2. Ex.7. Використовуючи текст, складіть список слів, які називають основні методи дослідження хворих і цілі їх використання. Складіть пропозиції з цими словами.
  3. I. Методи прискореного виведення токсичних речовин з організму
  4. II. Категорії і методи політології.
  5. II. Методи кількісного визначення білків

Розподільна хроматографія амінокислот

Розподільна хроматографія - метод аналізу амінокислот і їх сумішей. Завдання аналізу сумішей амінокислот часто зустрічається в разі аналізу (експертизи якості, визначення автентичності) лікарських препаратів, біологічно активних добавок, продуктів харчування та кормів. В останніх двох випадках цей аналіз також необхідний для визначення харчової цінності. У біохімічної дослідницькій практиці хроматографія амінокислот застосовувалася для визначення амінокислотного складу білків та дослідження обміну речовин.

Метод розподільної хроматографії використовується для поділу амінокислот. В основі методу лежить той факт, що амінокислоти мають різну розчинність в різних розчинниках. У розподільній хроматографії завжди використовується два розчинника, що не змішуються один з одним. Ці розчинники називають «фази». Для аналізу різних речовин використовуються різні фази і їх поєднання, а вибір фаз залежить від структури речовин, що розділяються. Проте, для одного аналізу завжди потрібно тільки дві фази. У разі розподільної хроматографії на папері або силікагелі однієї з фаз є вода, інший - органічний розчинник (або їх суміш), насичений водою. Вода в даному випадку нерухома (нерухома фаза), так як сорбированная (нерухомо закріплена) на інертному носії (целюлози, силікагелі), який в атмосферному повітрі утримує до 15% води, залишаючись зовні сухим. Насичений водою органічний розчинник (рухома фаза) переміщається щодо нерухомої фази за рахунок капілярного ефекту. Чим більше розчинність амінокислот у воді (нерухомій фазі) і менше в органічному розчиннику (рухомий фазі), тим повільніше рухається амінокислота по носію. При цьому амінокислоти переміщаються по носію за рахунок руху рухомої фази.

Виконання методу зводиться до того, що на хроматографічний папір або силікагель (інертний носій) в одну точку наносять досліджуваний розчин суміші амінокислот і висушують. Папір або пластинки з силікагелем приводять у контакт з сумішшю органічних розчинників, які внаслідок капілярного ефекту переміщаються по носію. У міру просування розчинника суміш амінокислот буде розділятися, причому ті з них, які розчиняються в органічному розчиннику більше, просуваються уздовж носія далі, ніж ті, що розчиняються менше. Коли фронт розчинника наближається до протилежного краю носія, процес припиняють і папір або пластинку з силікагелем висушують. Амінокислоти, на отриманої таким чином хроматограмме, виявляють за допомогою реагенту, що дає з амінокислотами кольорову реакцію. Окремі амінокислоти виявляються у вигляді кольорових плям, розташованих на різних відстанях від місця нанесення досліджуваної суміші.

Швидкість переміщення окремих амінокислот може бути виражена у вигляді величини їх хроматографічної рухливості (Rf). Хроматографічної рухливістю називається відношення відстані від місця нанесення амінокислоти до середини її плями до відстані від місця нанесення амінокислоти до фронту розчинника:

величина Rf є характерною величиною для кожної амінокислоти і постійна за даних умов досвіду (розчинник, температура, носій і ін.).

Найбільш часто ідентифікація амінокислот на хроматограмах проводиться шляхом використання чистих амінокислот - «стандартів», що наносяться на ту ж хроматограму.

Розподільна хроматограмма може бути виконана кількома способами. Нижче наводиться два способи такої хроматографії.

Як звіт про виконану роботу:

1. Заповніть таблицю

 Носій Rf
 аспарагінова кислота  пролин  изолейцин
 хроматографічна папір      
 силікагель      

2. Прикладіть отримані хроматограми

3.1 Радіальна хроматографія

Нанесення розчину на хроматографічний папір:

Беруть беззольний фільтр з бистрофільтрующей паперу діаметром 11-14 см. Фільтр перегинають за діаметрами, перпендикулярним один одному. У точці перетину ліній згину (центр фільтра) вирізують отвір діаметром близько 3 мм. На відстані близько 1 см від центрального отвору простим олівцем відзначають точки. У ці точки за допомогою каліброваних скляних капілярів об'ємом 5 мкл наносять розчини, які досліджувалися. У кожну точку наносять один повний капіляр. В одну з точок наносять досліджувану суміш амінокислот. В останні точки наносять розчини амінокислот - «стандартів», що входять в суміш: проліну, аспарагінової кислоти, ізолейцину. Після нанесення кожної краплі розчину папір просушують в струмі теплого повітря і лише потім наносять наступну краплю. Краплю наносять з розрахунком, щоб пляма від неї не перевищувало 3 мм по діаметру. Після нанесення підписують простим олівцем у зовнішнього краю диска що і де було нанесено. Для нанесення використовують розчини амінокислоти проліну, аспарагінової кислоти, изолейцина по 5 мг / мл в 0,5 н. НCl і їх равнооб'емние суміш. Хроматограму ретельно висушують.

Проведення хроматографії:

З другого фільтра вирізують смужки шириною близько 1,5 см, довжиною 5-7 см. Ці смужки згортають в якомога більш тонкі трубочки, які потім вставляють в центральний отвір дисків (роблять гніт). Хроматограму з гнітом поміщають між двома половинками чашок Петрі з однаковим діаметром, що утворюють хроматографическую камеру, так, щоб гніт хроматограми був занурений в систему розчинників, яку наливають у нижню чашку. Як системи розчинників використовують: н-пропанол-аміак-вода в об'ємному відношенні 6: 3: 1. Хроматографічне розділення проводять при кімнатній температурі протягом 30 -40 хв.

Насичений водою розчинник вбирається гнітом і рухається по паперовому диску, захоплюючи нанесення речовини. Цей призводить до поділу досліджуваної суміші на окремі амінокислоти, відповідно до коефіцієнтів їх хроматографічної рухливості

Виявлення амінокислот:

Після закінчення 30-40 хв, коли фронт розчинника пройде шлях близько 4-5 см, хроматограму витягують з камери, ретельно сушать на протязі 4-5 хв в потоці повітря при температурі 60-80С для видалення розчинника. Після цього хроматограму обприскують з пульверизатора розчином нингидрина в ацетоні і поміщають в потік гарячого повітря на 5 хвилин при температурі 80С. На хроматограмі з'являються кольорові плями. Кожна пляма відповідає окремій амінокислоті (жовте - пролін, сіро-синє - аспарагінова кислота, червоно-фіолетове - ізолейцин). Зіставляючи положення плям досліджуваного розчину з положенням плям «стандартів», визначають наявність тих чи інших амінокислот в досліджуваній суміші (рис. 9)

Мал. 9. Радиальная хроматограмма

3.2 Тонкошарова хроматографія

Для тонкошарової хроматографії амінокислот використовують готові комерційні пластинки. В якості підкладки для виготовлення цих платівок використовується алюмінієва фольга. На ній нанесено тонкий шар крупнопористого силикагеля, пов'язаний золем кремнієвої кислоти, для додання цій верстві великий механічної міцності.

З виданого листа 20х20 см вирізати пластинку 5х5 см. На платівці відзначити 4 стартові точки на відстані 1 см від краю. На одну з цих точок наносять суміш амінокислот, а на інші - окремі амінокислоти в якості «стандартів». Розчини амінокислот наносять, як описано для радіальної хроматографії, але зону нанесення розтягують в невелику горизонтальну смужку довжиною 3-5 мм (рис. 10).

Після ретельного висушування нанесених плям, хроматографическую пластинку поміщають в хроматографічну камеру. Кінець пластинки занурюють на 0,5 см в систему розчинників таким чином, щоб місця нанесення амінокислот залишилися над розчинником. Хроматографію проводять при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, поки фронт розчинника повністю не пройде всю платівку. Після цього пластинку виймають з камери, відзначають положення фронту розчинника, висушують, обприскують нингидрином і виявляють в струмі гарячого повітря, як описано для радіальної хроматографії.

Мал. 10. Тонкошарова хроматограмма

3.3 Визначення змісту амінокислот формольного титруванням

Метод формольного титрування (або титрування по Сёренсену) застосовується для визначення кількість амінокислот, присутніх в зразку. Визначення амінокислот використовується для контролю якості ліків, харчових добавок і кормових сумішей, культуральних середовищ в мікробіології та біотехнології (в тому числі культурі тканини клітин рослин і тварин), також визначення амінокислот необхідно для контролю якості сировини і хімічних технологічних процесів.

Суть формольного титрування полягає в тому, що аміногрупи амінокислот блокуються формальдегідом, а що залишилися вільні карбоксильні групи титрують лугом:

За кількістю витраченого на титрування лугу визначають кількість СООН-груп. В середньому число карбоксильних груп в амінокислотах приймають рівним числу аминогрупп (що цілком справедливо для моноаминокислотах, для діамінокіслот вводяться відповідні поправки в методику титрування). Також формольного титруванням можуть визначатися солі амонію (присутність яких в пробі буде заважати визначенню амінокислот).

У даній роботі вам пропонується визначити зміст амінокислоти L-гліцину (моль-маса 75,1 г / моль) в лікарському препараті (таблетки «Гліцин-Біо»).

Як звіт про виконану роботу:

1. Запишіть схеми реакцій

2. Заповніть таблицю

 маса порожнього стакана (г):
 маса склянки з таблетками (г):
 маса таблеток (г):
 обсяг лугу, що пішов на титрування (мл):
 дослідної проби  контрольної проби
 1.  1.
 2.
 3.
 середнє  середнє
 маса гліцину в одній таблетці (мг):

3. приведіть розрахунок змісту гліцину в одній таблетці по формулі.

Для кількісного визначення амінокислот методом формольного титрування доводиться користуватися мікробюретки в зв'язку з малою кількістю аналізованого речовини. Мікробюретки дозволяють проводити достатню точне титрування при обсягах титранту від 0,5 до 5 мл. Найбільш часто використовується мікробюретки Банга (рис. 11)

Приступаючи до роботи з мікробюретки необхідно заповнити титрантом резервуар 1, а потім видалити всі повітряні бульбашки з трубки для заповнення бюретки і її мірного коліна, по черзі відкриваючи й закриваючи крани 3 та 4. При цьому варто бути обережним: не допускати переповнення мірного коліна і випліскування титранту , а також випорожнення резервуара 1 так як останнє призводить до необхідності повторно виганяти повітряні бульбашки з бюретки. Потім бюретки необхідно триразово промити розчином титранту шляхом заповнення і спорожнення мірного коліна. Після закінчення роботи бюретки необхідно тричі промити дистильованою водою. Залишати титрант в бюретці не можна, так як це призводить до заїдання кранів і виходу бюретки з ладу (особливо, якщо титрант - розчин лугу)

Мал. 11. мікробюретки Банга.

1-резервуар для титранту, 2 трубка для заповнення бюретки, 3 - кран для заповнення бюретки, 4 - кран для титрування, 5 - підставка, 6 - мірне коліно бюретки.

Хід роботи:

На аналітичних вагах зважити стакан об'ємом 100 мл

Помістити в стакан 2 таблетки гліцину по 100 мг, зважити стакан вдруге

За різницею мас визначити масу таблеток.

Внести в стакан 50 мл дистильованої води, за допомогою мірного циліндра. Розчинити таблетки, при перемішуванні скляною паличкою.

Профільтрувати розчин через складчастий фільтр в мірну колбу

Обмити стаканчик і паличку дистильованою водою тричі (приблизно по 10 мл). Промивні води також профільтрувати в мірну колбу

Довести дистильованою водою до мітки. перемішати

Провести контрольне титрування:

Піпеткою Мора відібрати 10 мл дистильованої води в конічну колбу об'ємом 25 мл.

Піпеткою мору долити 5 мл формольного суміші.

Титрувати ~ 0,1 н. розчином їдкого натру з мікробюретки до слабо-рожевого забарвлення.

Записати обсяг лугу, що пішов на контрольне титрування.

Титрування проводиться тричі.

Потім провести дослідне титрування наступним чином: до 10 мл отриманого розчину таблеток долити 5 мл формольного суміші і титрувати ~ 0,1 н. розчином їдкого натру з мікробюретки до слабо-рожевого забарвлення.

Записати обсяг лугу, що пішла на дослідне титрування.

Титрування проводиться тричі.

Розрахувати кількості гліцину Х (мг) в 1 таблетці за такою формулою:

де А0 і Ак - Кількість 0,1 н. розчину гідроксиду натрію, який пішов на титрування дослідної та контрольної проб відповідно, мл; 7,51 - кількість гліцину (мг), що відповідає 1 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію (1 мл нормального розчину лугу відповідає 75,1 мг гліцину азоту); 100 - загальний об'єм розчину для аналізу, мл; 10 - об'єм розчину, взятого для титрування, мл; 2 - кількість таблеток, взятих на аналіз; Т / 0,1 - нормальність розчину їдкого натру поділена на 0,1.

Точне значення нормальності розчину їдкого натру повідомляє викладач.

Питання для самопідготовки

У чому практичне значення формольного титрування?

На яких реакціях засновано формольного титрування?

На якому принципі заснована розподільна хроматографія амінокислот?

Що таке фаза?

У чому різниця між рухомою і нерухомою фазами?

Що таке хроматографічна рухливість, від чого вона залежить?

Що таке Rf, Запишіть вираз для цієї величини?

За допомогою якої реакції виявляють амінокислоти на хроматограмах?

У чому практична значущість розподільної хроматографії амінокислот?



Робота зі спектрофотометром | колоїдні властивості

I. Хімічні властивості білків | Робота з автоматичною піпеткою | II. Методи кількісного визначення білків | розчинність білків | електрофорез білків | Додаток. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати