На головну

Робота зі спектрофотометром

  1. II. Робота з Internet Explorer (провідник)
  2. III. Виконайте вправи Працюючи в парі, перевірте вибірково знання фраз, які використовуються в телефонних розмовах.
  3. III. Корекційна робота при дисграфії «аналізу синтезу».
  4. Quot; Не стій під стрілою! Працюй! "Команда КВН МІСД
  5. V. Порядок проведення Конкурсу та вимоги до конкурсних робіт
  6. VI. Робота з базою даних.
  7. А. Робота на моделі кута.

Для визначення оптичної щільності розчинів використовується спектрофотометр UVmini 1240 (Shimadzu, Японія). Даний прилад працює в інтервалі довжин хвиль 190 - 1100 нм і зібраний по однолучевой схемою. Спектрофотометр (рис. 3) забезпечений рідкокристалічним дисплеєм (1), що відображає стан інструменту і значення оптичної щільності; клавіатурою (2), що служить для управління і кюветним відділенням (3), в яке поміщається досліджуваний розчин. Гвинти (4), що знаходяться на передній поверхні приладу служать для кріплення Кюветотримач всередині кюветного відділення.

 

 

Мал. 3. Спектрофотометр UVmini 1240. А - вид зверху. Б - вид спереду.

1 - рідкокристалічний дисплей, 2 - клавіатура, 3 - кюветное відділення, 4 - гвинти кріплення Кюветотримач

 

На задній поверхні спектрофотометра (рис. 4) знаходиться роз'єм для підключення мережного шнура (1), відсік з плавкими запобіжниками (2) і мережевий вимикач (3), необхідні для підключення електроживлення. Також на задній поверхні приладу знаходяться роз'єми для підключення персонального комп'ютера (RS-232 - порт, 4), додаткових модулів (5, 6) і принтера (7).

 

Мал. 4. Задня поверхня спектрофотометра UVmini 1240.

Пояснення см. В тексті

Клавіатура спектрофотометра UVmini 1240 (рис. 5) служить для керування приладом. Кнопка «START / STOP» (1) служить для запуску вимірювання. Кнопка «AUTO ZERO» (2) служить для обнулення поточного значення оптичної щільності, тобто установки початку відліку для визначення оптичної щільності проби. Кнопка «GOTO WL» (3) служить для установки довжини світлової хвилі, на якій проводяться вимірювання. Кнопка «ENTER» (4) служить для підтвердження введення параметрів роботи приладу. Кнопки курсору (5) служать для переміщення по меню і зміни значення числових параметрів роботи приладу. Функціональні кнопки (6) відповідають функціям, що позначається в нижньому рядку дисплея приладу. Кнопка «RETURN» (7) служить для перемикання між поточним і попереднім вікнами меню. За допомогою кнопки «LCD CONT» (8) налаштовується контрастність дисплея. Кнопка «PRINT» (9) дозволяє вивести на друк поточний вид дисплея. Числові клавіші (10) служать для введення числових значень (наприклад, довжини хвилі). Кнопка «CE» призначена для скидання неправильних числових значень.

 

 

Мал. 5. Клавіатура спектрофотометра UVmini 1240.

Пояснення см. В тексті

 

Для проведення вимірювань за допомогою спектрофотометра, необхідно:

1. слід підключати до електричної мережі.

2. Включити мережевий вимикач на задній поверхні приладу.

Після включення приладу в мережу починається самотестування спектрофотометра - відбувається перевірка справності всіх його вузлів

3. Дочекатися закінчення самотестування приладу.

При успішному проходженні самотестування на дисплеї приладу з'являється таблиця, яка містить перелік перевірених вузлів (рис. 6)

 

 

Мал. 6. Таблиця самотестування спектрофотометра UVmini 1240

 

4. Після закінчення самотестування перейти в фотометричний режим.

Після успішного самотестування автоматично слідом за таблицею самотестування на дисплеї з'являється меню для вибору режиму роботи спектрофотометра (рис. 7)

 

Рис.7. Меню вибору режиму роботи спектрофотометра UVmini 1240

 

Щоб перейти в фотометричний режим роботи необхідно на клавіатурі натиснути «1» на числовий клавіатурі. Після цього на дисплеї з'являється вікно фотометрического режиму спектрофотометра (рис. 8)

 

 

Мал. 8. Вікно фотометрического режиму.

 

5. Після переходу в фотометричний режим встановити довжину світлової хвилі, необхідної для вимірювання.

Для установки довжини, хвилі необхідно натиснути кнопку «GOTO WL», а потім ввести значення довжини хвилі з числової клавіатури, після закінчення натиснути клавішу «ENTER». На дисплеї з'являється поточне значення довжини хвилі і оптичної щільності.

6. Після установки довжини хвилі необхідно встановити нульове значення оптичної щільності.

Від даного значення буде відраховуватися оптична щільність досліджуваних розчинів. Для установки нуля в кюветодержатель встановити кювету з розчином порівняння. Потім натиснути кнопку «AUTO ZERO», значення оптичної щільності на дисплеї прийме нульове значення. Необхідно пам'ятати, що при кожній зміні довжини хвилі і розчину порівняння необхідно заново встановлювати нуль оптичної щільності.

 

2.1 Метод ультрафіолетового поглинання

 

Метод заснований на здатності ароматичних амінокислот (триптофану, тирозину і в меншій мірі фенілаланіну) поглинати ультрафіолетове світло з максимумом при 280 нм. Вимірюючи величину оптичної щільності при цій довжині хвилі, можна знайти концентрацію білка в розчині. Інтенсивність поглинання світла різними білками в ультрафіолетовій області спектра може сильно відрізнятися внаслідок різного вмісту ароматичних амінокислот. Умовно вважають, що при концентрації «усередненого» білка в розчині, що дорівнює 1 мг / мл, величина оптичної щільності при 280 нм дорівнює 1,0 (при товщині шару рідини в 1 см)

Визначенню білка даним методом заважає присутність нуклеїнових кислот і нуклеотидів. Цих труднощів можна уникнути, вимірюючи оптичну щільність розчину при 260 нм (для обліку поглинання сполук нуклеотидной природи) і 280 нм. Вміст білка, в цьому випадку, можна знайти за формулою Калькара:

 

С (мг / мл) = 1,45А280 - 0,74А260

 

Також, концентрацію білка в розчині можна визначити за допомогою методу каліброваного графіка, використовуючи вимір тільки при довжині хвилі 280 нм.

Хід роботи:

П'ять пробірок підписати від «1» до «5»

Приготувати серію розчинів для побудови калібрувального графіка.

Для цього в кожну з п'яти пробірок внести за допомогою автоматичної піпетки на 1000 мкл аліквоту фізрозчину (0,9% -ний розчин NaCl в дистильованої воді) і вихідного розчину білка з концентрацією 2,5 мг / мл:

 

 номер пробірки  аліквотах фізрозчину  аліквотах розчину білка  концентраціябелка
 3500 мкл  500 мкл  0,31 мг / мл
 3000 мкл  1000 мкл  0,62 мг / мл
 2000 мкл  2000 мкл  1,24 мг / мл
 1000 мкл  3000 мкл  1,86 мг / мл
 4000 мкл  2,5 мг / мл

Кожен з отриманих розчинів, починаючи з «1» (розчин з найменшою концентрацією білка) і до «5» (концентрація білка максимальна) по черзі помістити в стандартну кварцову кювету і виміряти оптичну щільність при довжині хвилі 280 нм. Розчини фотометріровать проти чистого фізрозчину.

Після фотометрірованія побудувати калібрувальний графік: по осі «y» відкласти значення оптичної щільності, по осі «х» - концентрацію білка в фотометріровать розчинах. Графік повинен являти собою пряму лінію, що виходить з початку координат.

Після побудови калібрувального графіка виміряти оптичну щільність виданого розчину білка з невідомої концентрацією при довжинах хвиль 280 нм і 260 нм. Визначте концентрацію білка за калібрувальним графіком і за формулою Калькара.

 

2.2 біуретового метод (мікро-модифікація)

 

В основі даного методу визначення концентрації білка лежить, вже відома вам з I розділу, биуретовая реакція. Даний метод має кілька різних варіантів, що розрізняються необхідними для аналізу обсягами проб, інтервалами визначаються концентрацій, складом реакційної суміші. Загальним для всіх методів є сильнощелочной середа реакції і наявність іонів двухвалентной міді. Визначенню заважає присутність солей амонію.

Хід роботи:

П'ять пробірок підписати від «1» до «5»

Приготувати серію розчинів для побудови калібрувального графіка.

Для цього в кожну з п'яти пробірок внести за допомогою автоматичної піпетки на 1000 мкл і 200 мкл аліквоту фізрозчину (0,9% -ний розчин NaCl в дистильованої воді) і вихідного розчину білка з концентрацією 5 мг / мл:

 

 номер пробірки  аліквотах фізрозчину  аліквотах розчину білка  концентраціябелка
 1950 мкл  50 мкл  0,125 мг / мл
 1900 мкл  100 мкл  0,25 мг / мл
 1800 мкл  200 мкл  0,5 мг / мл
 1700 мкл  300 мкл  0,75 мг / мл
 1600 мкл  400 мкл  1 мг / мл

У кожну пробірку додають 2 мл 6% -ного розчину NaOH і перемішують

Потім в кожну пробірку додати 0,2 мл реактиву Бенедикта, перемішати.

Шосту пробірку підписати «Х» (неодружена), внести в неї 2 мл фізрозчину, а потім розчин їдкого натру і реактив Бенедикта як описано вище.

Інкубувати 15 хвилин.

Кожен з отриманих розчинів, починаючи з «1» (розчин з найменшою концентрацією білка) і до «5» (концентрація білка максимальна) по черзі помістити в стандартну скляну кювету і виміряти оптичну щільність при довжині хвилі 330 нм. Розчини фотометріровать проти холостий проби.

Після фотометрірованія побудувати калібрувальний графік: по осі «y» відкласти значення оптичної щільності, по осі «x» - концентрацію білка в фотометріровать розчинах. Графік повинен являти собою пряму лінію, що виходить з початку.

З виданими розчином білка (2 мл) з невідомою концентрацією провести всі маніпуляції як описано вище і виміряти його оптичну щільність проти холостий проби.

За отриманим каліброване графіком визначити концентрацію білка.

 

Питання для самопідготовки

 

Які фотометричні методи визначення білка ви знаєте?

На чому грунтується визначення білка методом ультрафіолетового поглинання?

Які сполуки заважають визначенню білка методом ультрафіолетового поглинання?

Яка якісна реакція лежить в основі біуретового методу визначення білка, що ця реакція відкриває?

Які сполуки заважають визначенню білка біуретовим методом?

У яких областях діяльності використовується кількісне визначення білка?

Що таке оптична щільність, запишіть вираз для оптичної щільності (закон Бугера-Ламберта-Бера)?

Що таке спектрофотометр, перерахуйте його основні вузли?

 



II. Методи кількісного визначення білків | III Методи аналізу амінокислот

I. Хімічні властивості білків | Робота з автоматичною піпеткою | колоїдні властивості | розчинність білків | електрофорез білків | Додаток. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати