Головна

Лабораторні методи аллергодиагностики

Ці методи можуть широко використовуватися при алергічних захворюваннях у фазі загострення, в період масивного контакту з алергеном, при високій чутливості хворих до алергену, при наявності протипоказань, у дітей, при ідентифікації професійних алергічних захворювань, так як виключають можливість появи неспецифічних, ложноаллергіческіх реакцій.

До методів, що виявляє алергічні реакції негайного, В-залежного типу, відносяться:

а) визначення загального IgE (проте, його високий рівень може бути і у продуктивній фазі імунної відповіді),

б) визначення алерген-специфічних IgE і IgG4.

Рівень IgE іIgG4 визначаються методом ІФА (см.лаб.занятіе 6).

Виявлення IgE і IgG4 проводиться щодо більш ніж 400 алергенів, що включають харчові алергени; алергени бактерій і грибів, вовни і лупи тварин, пір'я птахів; алергени пилку трав і дерев; алергени кліщів, домашнього і бібліотечного пилу, отрут комах; лікарські та професійні алергени.

В даний час розроблені тест-системи, що дозволяють здійснювати множинну діагностику специфічних IgE. Множинний аллергосорбентний тест із застосуванням хемілюмінесцентного аналізу (MAST-CLA, або алерготести МАСТ) дозволяє одномоментно визначити до 36 алергенів, використовуючи малий обсяг сироватки (0,75 мл). Для проведення тесту використовується МAСT-аллергопанель, що представляє собою порожнистий прозорий пластмасовий корпус з паралельно розташованими всередині найтоншими целюлозними нитками, на яких сорбованих алергени (рис. 9.1).

 
 

Примітка: 1 - МАСТ-панель в зборі, 2 - кришка,

3 - целюлозні нитки з адсорбованим алергеном, 4 - корпус

Мал. 9.1 Принцип хемілюмінесцентного аналізу при проведенні МАСТ

Сутність алерготести МАСТ полягає в проведенні реакції зв'язування алергену зі специфічним IgE з подальшим міченням утворився комплексу фотореагент і визначенням його світіння, інтенсивність якого пропорційна концентрації специфічного IgE в сироватці пацієнта. МАСТ аллергопанель заповнюється (звичайним шприцом) сироваткою пацієнта, інкубується при кімнатній температурі 16-24 години. Потім після промивання панелі звичайної дистильованою водою з буфером, вона заповнюється кон'югатом (анти-IgG, мічені пероксидазою) і інкубується протягом 4 годин. Далі після промивання панель заповнюється фотореагент і аналізується в люмінометр. Прилад реєструє клас величин від 0 до 4 відповідно до рівня люмінесценції від кожної індивідуальної нитки панелі. Ці класи відповідають класам шкірних проб. Рівні IgE, відповідні класам алергії МАСТ і показаннями люмінометра, представлені в таблиці 9.2

Таблиця 9.2

Інтерпретація результатів при проведенні множинного аллергосорбентного тесту

 МАСТ клас  Счітиваемиевелічіни, LU  Рівень аллерго- специфічних IgE  КонцентраціяIgE, нг / мл
 > 242  Дуже високий  > 24.00
 143-242  високий  > 12.00
 66-142  середній  > 6.00
 27-65  низький  > 1.68
 1/0  12-26  Дуже низький  > 0.52
 0-11  невизначених

Поряд з виявленням специфічних IgE використовуються і інші лабораторні тести для діагностики як антителозависимой реакцій, так і реакції уповільненого типу. Дані методи дозволяють вивчити особливості патогенезу алергічних реакцій. До них відносяться:

- Реакція дегрануляції огрядних клітин або базофілів,

- Реакція гальмування міграції лейкоцитів крові (РТМЛ),

- Реакція пошкодження нейтрофілів (РПН),

- Визначення вільного пов'язаного гістаміну,

- Визначення ІЛ 4,5,6, TGFb,

- Визначення триптази і хімотріптази (тріптаза, особливо ?-форма, може бути виявлена ??в крові через 4 години після анафілактичної реакції і служить клінічним маркером анафілаксії),

- Визначення лейкотрієнів (LTC4, LTD4, LTE4) за допомогою клітинного тесту вивільнення медіаторів,

- Визначення кількості активованих базофілів, що експресують на поверхні антиген CD63 (gp53) у відповідь на стимуляцію алергеном (цитометричного аллергенстімулірующій клітинний тест, ЦАСК-тест).

Визначення цих показників дозволяє зрозуміти індивідуальні особливості перебіг алергічних реакцій, що важливо для лікування пацієнта.

Клітинний тест вивільнення медіаторів заснований на визначенні сульфідолейкотріенов (LTC4, LTD4, LTE4), секретується базофілами під дією алергену in vitro(Рис. 9.2). Його також називають провокативним тестом in vitro. Завдяки синтезу сульфідолейкотріенов de novo цей тест має більш високу специфічність у порівнянні з класичним тестом вивільнення гістаміну. Протокол дослідження включає три етапи:

1) виділення популяції лімфоцитів з стабілізованою ЕДТА крові,

2) стимуляція лимфоцитарной суспензії специфічними алергенами,

3) імуноферментний аналіз синтезованих базофилами лейкотрієнів під час стимуляції.

РЕ- фікоеритрин
 
 

, FITC-флуоресцеінізотіоціанат, CAST (CellularAntigenStimulationTest) - клітинний тест вивільнення медіаторів, FLOW-CAST - цітометріческійантітген стимулюючий клітинний тест (ЦАСК-тест)

Малюнок 9.2 Принцип тестів антигенної стимуляції базофілів

Тест вважається позитивним для харчових, інгаляційних алергенів, латексу, отрут комах при визначенні рівня лейкотрієнів 200 пкг / мл; для лікарських алергенів, а також харчових і хімічних добавок 40 пкг / мл.

Цитометричного варіант тесту стимуляції базофілів - цитометричного антиген, що стимулює клітинний тест (ЦАСК-тест) дозволяє визначити кількості активованих базофілів, що експресують на поверхні антиген CD63. Етапи виділення лімфоцитів і стимуляції їх антигенами для обох варіантів (імуноферментного і цитометричного) ідентичні. Але замість сульфідолейкотріенов на третьому етапі визначається кількість активованих базофілів, що експресують на поверхні антиген CD63 (gp53) у відповідь на стимуляцію алергеном. Тест високочутливий і специфічний при реакціях анафілактичного типу, особливо при лікарської гіперчутливості.

При ЦАСК-тесті виділені лейкоцити инкубируют зі стимулюючим буфером і алергеном. Потім додають анти-IgE моноклональні Ат з флюоресцентной міткою для ідентифікації базофілів, після чого додають моноклональні Ат до CD63 (див. Рис. 9.2), і на поверхні базофілів визначають експресію CD63 АГ методом проточної цитометрії. Наприклад, для харчових і інгаляційних алергенів тест вважається позитивним при експресії CD63 на поверхні 15% базофілів; для отрут комах - 10%; бета-лактамних антибіотиків і анальгетиків - 5% базофілів і індекс стимуляції 2. Розраховують індекс стимуляції, який визначається як відношення CD63+ базофілів в пробі з алергеном (в%) до кількості цих клітин в пробі без алергену (в%).

ЦАСК-тест специфічний для визначення IgE-опосередкованої алергії до інгаляційних алергенів (коли шкірні проби не можна проводити через небезпеку розвитку спазми бронхів і астматичного статусу), пилкових, ліків, бета-лактамних антибіотиків, миорелаксантам, анальгетиків, алергії до латексу, укусів перетинчастокрилих комах, псевдоаллергических реакцій до протизапальних нестероїдних препаратів, індукованим компонентами комплементу, плазмою, визначення аутоантитіл до IgE. Результати ЦАСК-тесту добре корелюють з результатами шкірних проб.

Обидва тести високоспецифічні для діагностики харчової алергії і нестерпності, інгаляційної алергії, коли шкірні тести не можуть бути використані (при алергії на латекс, укуси перетинчастокрилих комах, алергії у дітей, лікарської алергії і нестерпності, різних псевдоаллергических реакцій).

Застосування ЦАСК-тесту і клітинного тесту вивільнення медіаторів в діагностиці харчової алергії і нестерпності, псевдоаллергических реакцій може бути використано для складання гіпоалергенної і елімінаційної дієти.

Діагностика псевдоаллергических реакцій. Псевдоаллергические реакції по клінічній симптоматиці можуть бути схожі з істинними IgE-опосередкованими реакціями, але відрізняються за механізмом розвитку. Їх розвиток не пов'язане з виробленням Ат або участю сенсибілізованих лімфоцитів, в патогенезі цих реакцій виділяють тільки дві стадії - патохимическую і патофизиологическую. У зв'язку з цим у таких пацієнтів в сироватці крові зазвичай концентрація IgE знаходиться в межах норми.

Однак при псевдоаллергических реакціях відбувається неспецифічне вивільнення медіаторів: гістаміну, лейкотрієнів, простагландинів. Тому для діагностики псевдоаллергических реакцій використовуються ЦАСК-тест для виявлення активованих базофілів і клітинні тести вивільнення медіаторів для встановлення концентрації LTC4, LTD4 і LTE.



Провокаційні алергічні тести | II. Методичні вказівки до виконання лабораторної роботи

Визначення загального IgE методом імуноферментного аналізу в сироватці крові людини | II. Методичні вказівки до виконання лабораторної роботи | I. Теоретична частина | Проведення реакцій іммунофенотіпірованія лімфоцитів | II. Методичні вказівки до виконання лабораторної роботи | I. Теоретична частина | проведення реакції | II. Методичні вказівки до виконання лабораторної роботи | I. Теоретична частина | Тести, що дозволяють виявляти сенсибілізацію до алергену |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати