На головну

Робота № 3. Поділ ізоферментів лактатдегідрогенази сироватки крові методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

  1. C) Кілька років працював Білоруський пересувний театр під керівництвом Владислава Голубка
  2. I. 9. Опишіть пристрій лабораторної установки по визначенню швидкості звуку методом резонансу.
  3. I. ПІДГОТОВЧА РОБОТА
  4. I. РОБОТА НАД ТЕКСТОМ
  5. I. ПІДГОТОВЧА РОБОТА
  6. II. 13. Чому дорівнює робота електростатичного поля при переміщенні заряду? Що таке циркуляція вектора?
  7. II. 17. Поясніть фізичну сутність визначення швидкості звуку методом резонансу.

Використання в якості середовища гелю поліакриламіду дозволяє домогтися високого дозволу при електрофорезі білків і ферментів, оскільки цей гель грає роль молекулярного сита, що забезпечує додатковий поділ частинок за молекулярною масою.

метод заснований на різній електрофоретичної рухливості ізоферментів ЛДГ, положення яких на стовпчиках поліакріламідного гелю виявляється за допомогою речовин, що переносять водень від лактату через феназінметасульфат на нітротетразоліевий синій. В результаті в місці знаходження фракції ЛДГ випадає фіолетово-синій осад діформазана.

Хід визначення. Для полімеризації гелю беруть сухі чисті скляні трубочки, закривають їх з одного кінця гумовими ковпачками, встановлюють в штативі строго перпендикулярно і вносять в них краплю розчину сахарози. Потім готують Полімеризується суміш, що складається з розчинів №1, №2, персульфата амонію і дистильованої води в співвідношенні 1: 2: 4: 1. суміші готують з розрахунку 2 мл на одну трубочку.

Приготовану Полімеризується суміш розливають в скляні трубочки, використовуючи по 2 мл на кожну. Потім на поверхню цього розчину обережно нашаровуються 0,2-0,3 мл дистильованої води піпеткою з тонким витягнутим кінцем (це покращує полімеризацію гелю в трубочках, яка протікає без доступу кисню повітря, і формує гладку поверхню гелю). Через 30 хв зазвичай полімеризація завершується, про що свідчить ясно помітна межа між поліакриламідних гелем і водою. Після цього перевертають трубочки і обережно струшують з гелю нашарувань воду, а залишки води видаляють з трубочки за допомогою фільтрувального паперу.

Скляні трубочки з заполімерізованним гелем закріплюють в гніздах верхньої камери для електрофорезу. На поверхню гелю в трубочці наносять спочатку 0,1 мл сироватки крові, потім такий же об'єм розчину сахарози і перемішують нанесення рідини скляною паличкою. Обережно нашаровуються на цю рідину розведений в 10 разів електродний буфер, заповнюючи їм простір до верхнього краю трубочки.

Нижню камеру апарату заливають тим же електродним буфером, встановлюють верхню камеру над нижньою так, щоб нижні кінці трубочок були занурені в електродний буфер. Потім верхню камеру теж заповнюють електродним буфером.

Апарат для електрофорезу ставлять в холодильник. Електроди підключають до джерела постійної напруги: нижній електрод до анода, верхній - до катода. Протягом перших 10 хв електрофорез проводять при силі струму 2мА на кожну трубочку. Потім силу струму збільшують до 4мА. Тривалість електрофорезу близько 90 хв.

Поки йде електрофорез, для виявлення ізоферментів ЛДГ готують в колбі инкубационную суміш наступного складу: розчини лактату натрію, хлориду натрію, хлориду магнію, НАД - по 1 мл, фосфатного буфера і НС- по 2,5 мл і ФМС - 0,25 мл, перемішують вміст колби.

Після закінчення електрофорезу гелі витягують з трубочок. Для цього використовують шприц на 10-20 мл з тонкою довгою голкою. Вводять голку між стінкою трубочки і гелем. Круговими рухами отслаивают гель, постійно видавлюючи воду зі шприца і просуваючи голку до протилежного кінця трубки. При цьому стовпчик гелю легко вискакує з трубки.

Стовпчик гелю поміщають в пробірки діаметром 7-8мм і наливають в них инкубационную суміш так, щоб весь стовпчик гелю був занурений в виявляється рідина. Пробірки ставлять в термостат при 370 З на 40-60 хв. Ферменти ЛДГ виявляються у вигляді синьо-фіолетових кілець на стовпчику гелю.

Після закінчення інкубації стовпчики гелю промивають водою, переносять в пробірки містять розчин оцтової кислоти, і зберігають в темряві.

Кількісну обробку гелевих ізоензімограмм проводять спектрофотометричним методом або за допомогою денситометрії. У першому випадку лезом вирізують забарвлені ділянки гелю, поміщають їх в пробірки і заливають 1 мл підігрітого до + 80-850З розчину диметилформаміду. Потім забарвлену рідину зливають в мікрокювет і вимірюють екстинкцію на спектрофотометрі або ФЕК при 540 нм проти розчину диметилформаміду.

Другий спосіб обробки полягає в скануванні гелів на мікроденситометри. Денсітограмми піддаються кількісній обробці.

Розрахунок. Відносну активність кожного изофермента х (%) висловлюють у відсотках від суми екстинкції всіх ізоферментів ЛДГ:

Х =ЕА ? 100%

?Е, де Е-екстинкція елюата изофермента із зони гелю, що відноситься до даного ізоферменту; ? Е сума екстинкції всіх ізоферментів; А- активність ЛДГ сироватки крові, ммоль / (ч · л).

Оформлення роботи. Замалювати отриману ізоензімограмму і розрахувати відносну активність ізоферментів ЛДГ (в%). Зробити висновок про зрушення спектра ізоферментів ЛДГ в досліджуваній сироватці і вказати на ймовірні причини цього явища.

Клініко-діагностичне значення. Склад ізоферментів ЛДГ має внутрішньоклітинну, тканинну і видову специфічність. Тканинні відмінності Ізофермент спектра ЛДГ з'явилися передумовою для використання його в діагностиці і прогнозі ряду захворювань, що супроводжуються некрозом тканин і органів. Відомо, що в серцевому м'язі, нервової тканини, нирках висока активність ЛДГ1 і ЛДГ2 (Ізоферменти Н-типу), в підшлунковій залозі і легеневої тканини переважає ЛДГ3, А в скелетної м'язі і печінки-ЛДГ4 і ЛДГ5 (Ізоферменти М-типу). При некрозі цих тканин знаходяться в них ізоферменти надходять в кров і змінюють її нормальний спектр. У нормі сироватка крові має приблизно такі співвідношення ізоферментів (в% від загальної активності): ЛДГ1-31, ЛДГ2-47, ЛДГ3-12, ЛДГ4-5, ЛДГ5- 4. При інфаркті міокарда збільшується частка ЛДГ1 і ЛДГ2 (Спектр зміщується в бік изоферментов Н-типу), причому цей зсув визначається розмірами вогнища некрозу в серце. Загоєння супроводжується нормалізацією складу ізоферментів в сироватці крові.

При інфекційному гепатиті підвищена відносна активність ЛДГ4 і ЛДГ5. Якщо вона зберігається при клінічному одужанні, то це свідчить про незавершеність відновних процесів в печінці.

При ураженні підшлункової залози (панкреатит), легеневої тканини збільшується відносна активність ЛДГ3 в сироватці крові. Збільшення активності ізоферментів середньої зони ЛДГ3 і ЛДГ4 спостерігається також при масивному руйнуванні тромбоцитів (емболії легеневої артерії, масивні гемотрансфузії) і залученні в патологічний процес лімфатичної системи.



Робота № 2. Фотоколориметричний метод дослідження активності лактатдегідрогенази в сироватці крові по Севели і Товареку. | УИРС. Дослідження амілазной активності сечі.

Методичні вказівки до самопідготовки | Приклади тестів контролю вихідного рівня знань | Приклади ситуаційних завдань | Самостійна робота студентів | Малонової кислотою. | Еталони відповідей на ситуаційні задачі | Методичні вказівки до самопідготовки | Основи імуноферментного аналізу | Приклади тестів контролю вихідного рівня знань | За Вольгемуту. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати