Головна

Порядок виконання роботи

  1. A. Порядок виконання роботи
  2. I Актуальність дипломної роботи
  3. I. 10. Опишіть принципову схему установки і хід виконання лабораторної роботи.
  4. I. Лабораторні роботи
  5. I. Організація практики та порядок її проходження.
  6. I. Цілі і завдання виконання курсової роботи
  7. I. Мета та завдання ВИПУСКНИЙ КВАЛІФІКАЦІЙНОЇ РОБОТИ

1. Пристрій приладу для електрофорезу. Прилад складається з випрямляча, що подає постійний струм необхідного напруги, і камери для електрофорезу. Сама камера складається з 2-х ванн; в одній з них є нерухома перегородка, куди поміщається платиновий електрод (+ анод), а в іншій знаходиться електрод з нержавіючої сталі (- катод). Між ваннами, заповненими відповідним буфером, є з'єднувальний міст, на який поміщають смужки спеціальної фільтрувального паперу.

2. Проведення електрофорезу. Заповнити обидві ванни камери розчином вероналового буфера з pH 8,6. Буферного розчину в ваннах має бути стільки, щоб він покривав нерухому перегородку, але був нижче рухомих перегородок.

Вставити в ванни електроди. Вирізати з фільтрувального паперу смуги необхідного розміру в залежності від величини камери (зазвичай шириною 4-6 см) і простим олівцем відзначити місце, на яке згодом буде наноситися сироватка (старт). Змочити ці смужки в вероналовом буфері. Вставити в ванни-камери з'єднувальний міст. Помістити смужки паперу на сухі пластинки щипцями, зануривши кінці смужок в ванни з буфером, і на заздалегідь відмічені ділянки паперу нанести сироватку по 0,025-0,005 мл на відстані 5-6 см від краю моста. Нанесення сироватки виробляється з боку катода.

Малюнок 1. Схема камери для електрофорезу білків на папері:

1-стабілізатор; 2-камера для електрофорезу; 3-буферний розчин; 4-підтримуючий з'єднувальний міст-електрод; 5-фільтрувальна папір для електрофорезу.

Після нанесення на паперові смужки сироватки камера герметично закривається кришкою. На кришці камери розташований притиск блокування, службовець для включення камери. Приєднаний випрямляч подає до камери постійний струм від 2 до 4 мА при постійній напрузі 110-160В. Електрофорез проводять при градієнті потенціалу від 3 до 8 В на 1 см смуги при кімнатній температурі. Гарне поділ відбувається за 18-20 годин.

3. Виключення приладу і виявлення білкових фракцій. Вимикають прилад. Знімають камери і витягають паперові смужки з приладу. Потім кожну смужку поміщають в сушильну шафу на 20 хвилин при температурі 1050С. При цьому відбувається фіксація білкових фракцій на папері. Забарвлення білків проводять розчином бромфенолового-синього протягом 30 хвилин, потім промивають електрофореграми 2% розчином оцтової кислоти. Отримані електрофореграми сушать на повітрі. Білкові фракції фарбуються в синьо-зелений колір.

4. Кількісне визначення білкових фракцій. Пофарбовані білкові плями вирізують, барвник елюіруют 0,01 н розчином лугу. Інтенсивність забарвлення кожної фракції визначають колориметрически на ФЕК.

Кількісне визначення білкових фракцій на електрофореграмме можна встановити двома способами: шляхом елюювання фарби і фотоколоріметрірованія і денситометрическое методом.

Зміст білкових фракцій сироватки крові, отримане за допомогою електрофорезу на папері, в середньому становить у дорослої людини:

альбуміни 55,4-65,9%

?1глобуліни 3,4-4,7%

?2глобуліни 5,5-9,5%

?-гдобуліни 8,9-12,6%

?-глобуліни 13-22,2%

Денситометричний метод. У спеціальному апараті (денситометрі) через електрофореграмме пропускають пучок світла, поглинання якого залежить від оптичної щільності забарвлених білкових плям. Світло, що пройшло через електрофореграмме, вловлюється фотоелементом і перетворюється в електричний струм, коливання якого фіксують на паперовому аркуші у вигляді кривої, кожен пік кривої відповідає певній білкової фракції.

Малюнок 2. Електрофореграма сироватки людини.

 



Фракцій сироватки крові методом електрофорезу на папері. | Робота № 2. Очищення білків від низькомолекулярних домішок методом діалізу.

Заняття № 2. Фізико-хімічні властивості білків. | Методичні вказівки до самопідготовки | Приклади тестів контролю вихідного рівня знань | Робота № 1. Висолювання білків сироватки крові сірчанокислим амонієм. | Робота № 2. Осадження білків при кип'ятінні. | Робота № 4. Осадження білків органічними кислотами. | Брандберга-Робертса-Стольнікова. | Еталони відповідей на ситуаційні задачі | Методичні вказівки до самопідготовки | Приклади тестів контролю вихідного рівня знань |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати