Головна

Додатковий матеріал до заняття.

  1. CD-диск «Колекція навчальних матеріалів». - М., - МФПА 2010.
  2. I.1. Пластичні тверднуть пломбувальні матеріали
  3. I.2. Нетвердеющіе пластичні пломбувальні матеріали
  4. II. Виклад нового матеріалу.
  5. II. Виклад нового матеріалу.
  6. II. Вивчення нового матеріалу.
  7. II. Фото МАТЕРІАЛІВ 1 сторінка

Різні види бактерій, в тому числі мають однакову морфологію, можуть відрізнятися по ферментативної активності. Тому неможливо такі види ідентифікувати тільки по їх морфології. Після виділення чистої культури бактерій вивчають їх ферментативну активність (біохімічні властивості). Для цього застосовуються диференційно-діагностичні середовища, наприклад, середовища Гіссен, середа Ендо, середа Левіна, середа Плоскірєва в чашках Петрі. Останні три середовища застосовуються для диференціації бактерій кишкової групи по їх здатності зброджувати лактозу. Ці середовища містять агар, лактозу і індикатор, що змінює свій колір в кислому середовищі (індикатор рН). Якщо посіяти на таке середовище бактерії, які зброджують лактозу, наприклад, кишкову паличку, то в результаті зброджування лактози утворюються кислі продукти, і індикатор змінює свій колір. Тому колонії кишкової палички на таких середовищах будуть пофарбовані відповідно кольору індикатора: на середовищі Ендо та середовищі Плоскірєва - в червоний колір, на середовищі Левіна в чорно-синій. Якщо ж на ці середовища посіяти бактерії, що не зброджують лактозу, реакція середовища залишиться слабо-лужний, і колір індикатора не зміниться. Тому, колонії бактерій на цих середовищах будуть безбарвними. Середовище Плоскирєва можна віднести також до елективний середах для виділення паличок дизентерії, так як це середовище містить солі жовчних кислот, що затримують зростання кишкової палички, і барвник діамантовий зелений, затримує зростання повітряної кокової флори.

Диференційно-діагностичні середовища Гіссен ( «строкатого» ряду) готуються на основі рідкого середовища (пептонною води) або напіврідкого м'ясо-пептонного агару. Середовища Гіссен містять будь-якої вуглевод або багатоатомний спирт (лактозу, глюкозу, маніт, сахарозу) і індикатор, який змінює свій колір в кислому середовищі. У пробірку з рідким середовищем Гисса поміщений скляний поплавок. Якщо на середу Гіссен посіяти мікроб, який зброжує даний вуглевод з утворенням кислоти і газу, тобто до кінцевих продуктів, то середовище змінить свій колір, в напіврідкої середовищі з'являться бульбашки і розриви в товщі агару, в рідкому середовищі - бульбашка газу в поплавці. При зброджуванні субстрату тільки до проміжних продуктів (до кислоти) відбувається тільки зміна кольору середовища.

Застосовуються такі комбіновані середовища, що містять не один вуглевод, а два або три, наприклад, середа Олькеницкого - трёхсахарний агар з сечовиною. Одна пробірка середовища Олькеницкого замінює скошений агар і середовища Гіссен з лактозою, сахарозою і глюкозою. Середовище готується на основі не дуже щільного МПА. Містить лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), сечовину, сіль Мора (сульфат заліза), гипосульфит натрію і індикатор. Середу після стерилізації в розплавленому вигляді наливають у пробірку і дають застигнути так, щоб вийшов стовпчик і скошена частина. Посів проводиться штрихом по скошеної частини і потім уколом в стовпчик. При зброджуванні вуглеводів, які містяться в середовищі в більшій кількості (лактози, сахарози) змінюється колір всього середовища, при зброджуванні тільки глюкози змінюється колір стовпчика, а скошена частина залишається без змін. Освіта газу визначається за наявністю пухирців в стовпчику агару. Культури, що розщеплюють сечовину з утворенням аміаку, дають лужну реакцію. При цьому відбувається нейтралізація кислоти, що утворюється при зброджуванні вуглеводів, і колір середовища не змінюється. Розщеплення сечовини властиво протея і деяким кишковим паличок. Патогенні ентеробактерії розкладають сечовину. Додавання солі Мора і гипосульфита дозволяє також вивчити здатність бактерій до утворення сірководню по почорніння в стовпчику агару в результаті перетворення сульфату заліза в сульфід чорного кольору.

протеолітичні ферменти у бактерій вивчають на середовищах з желатином, молоком, сироваткою, пептоном і на деяких поліуглеводних середовищах (наприклад, на середовищі Кліглера). Показниками глибокого розщеплення білка є утворення індолу, аміаку, сірководню.

сірководень виявляють за допомогою смужки фільтрувального паперу, просоченої розчином ацетату свинцю, яку закріплюють між стінкою засіяної пробірки і пробкою (при взаємодії сірководню і ацетату свинцю папір чорніє в результаті утворення сульфіду свинцю), або на середовищах, до складу яких входять солі заліза або свинцю, які при взаємодії з сірководнем дають чорне забарвлення самого середовища або виросли колоній (середовища Вільсона-Блера, Кліглера і т.д.).

для виявлення індолу за способом Мореля вузькі смужки фільтрувального паперу, змочені гарячим насиченим розчином щавлевої кислоти і висушені, поміщають між стінкою пробірки з поживним агаром і пробкою. При виділенні індолу на 2-3-й день нижня частина смужки паперу набуває рожевий колір. Інший, більш чутливий, метод виявлення індолу дозволяє концентрувати індол на поверхні середовища ксилолом або ефіром, а додавання розчину Ковача (парадіметіламінобензальдегіда) призводить до утворення червоного кільця. Індол утворюється при наявності у бактерій ферменту тріптофанази.

наявність аміаку визначають по посиніння рожевої лакмусового папірця, вміщеній між стінкою і пробкою засіяної пробірки.

желатинази. При посіві уколом в желатин деякі мікроби (холерний вібріон, стафілокок, сибиреязвенная паличка і ін.) При кімнатній температурі (20-22 ° С) розріджують його, причому різні види мікробів дають характерну для них форму розрідження (пошарово, у вигляді цвяха, ялинки і т.д.).

Інші протеолітичніферменти:

- При посіві на згорнуту сироватку навколо колоній з'являються поглиблення (розрідження);

- В молоці відбувається розщеплення згустку казеїну з утворенням пептона, в результаті чого воно набуває жовтуватий колір (пептонізація молока).

Наявність уреази у бактерій визначають на середовищі з сечовиною і індикатором фенол-рот (початковий колір середовища - жовтий). При розщепленні сечовини на аміак і вуглекислий газ накопичується амоній, що зрушує рН в лужну сторону і змінює колір індикатора на червоний.

Освіти ацетоина (ацетил-метил-карбінолу) при ферментації глюкози проводиться за допомогою реакції Фогес-Проскауера. Додавання до культури 40% КОН і 5% альфа-нафтол дає червоне забарвлення, тобто в лужних умовах ацетоін утворює з альфа-нафтолом сполука червоного кольору - ацетілметілкарбінол.

Утилізацію цитрату з метою виявлення здатності бактерій використовувати його як джерело вуглецю перевіряють на середовищі Сімонса. Середа містить набір солей, агар, неорганічний джерело азоту, цитрат натрію, індикатор бромтимоловий синій. При наявності у бактерій ферменту цитрат-пермеази середу подщелачивают і забарвлюється в синій колір. При відсутності продукції бактеріями цього ферменту середовище залишається зеленою.

Каталаза - це фермент, що каталізує реакцію розкладання перекису водню з утворенням води і кисню. Каталазу містять аероби і факультативні анаероби, але вона відсутня у облігатних анаеробів. Виявити каталазу можна за бульбашок кисню, які починають виділятися відразу ж після змішування мікробних клітин з 1% розчином перекису водню. На предметне скло поміщають краплю перекису водню і суспендують в ній невелику кількість культури мікроорганізмів, вирощеної на щільному середовищі.

Виявлення цитохромоксидази у аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів проводиться шляхом нанесення і розтирання петлі культури на індикаторну папірець, просочену спиртовим розчином альфа-нафтол та 1% водним розчином ментолу. При позитивному результаті папірець синіє.

Виявлення нітратредуктази характерно в основному для факультативних анаеробів. Фермент відновлює нітрати в нітрити. Нітрат є кінцевим акцептором електронів. У кислому середовищі нітрати окислюють йодид калію. Що виділився йод, реагуючи з крохмалем, дає синє забарвлення середовища.

Тест окислення / ферментації глюкози (в аеробних / анаеробних умовах) встановлюється на середовищі Хью-Лейфсона. У середовищі міститься агар, солі, пептони, глюкоза і індикатор бромтимоловий синій. Посів здійснюють уколом в стовпчик живильного середовища в дві пробірки. Для створення анаеробних умов після посіву середовище в одній з пробірок заливається шаром стерильного вазелінового масла. Посів вирощують 3-4 діб. Освіта кислоти з глюкози змінює зелений колір середовища в жовтий. При окисленні глюкози зміна кольору відбувається у верхній частині пробірки без вазелінового масла. При ферментації змінюється колір середовища під шаром вазелінового масла (в анаеробних умовах). Тест використовується для диференціації аеробних бактерій від анаеробів і факультативних анаеробів. Аероби (наприклад, Pseudomonas aeruginosa) розщеплюють глюкозу в аеробних умовах, тобто тільки окислюють глюкозу, але не ферментують її; анаероби (наприклад, Clostridium perfringens) утилізують глюкозу тільки в анаеробних (тобто ферментують). Факультативні анаероби (наприклад, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилізують глюкозу в аеробних і анаеробних умовах.

Для експрес-методу визначення ферментативної активності мікроорганізмів застосовуються мікротестсістеми і система індикаторні паперові (СІБ).

Діагностичні Мікротест-системи (МТС), типу API-20-Е (для ентеробактерій), API-32-Gr +, ID32 GN, Enterotube і інші представляють собою полістиролові пластини з лунками, або планшети, в яких містяться стерильні диференційно-діагностичні середовища або тільки субстрати та індикатори. Стерилізацію МТС проводять ультрафіолетовим опроміненням. Існує два основних типи таких систем. Це індивідуальні системи, розраховані на ідентифікацію однієї культури. До них відносяться тест-системи ПБДЕ, ПБДС (Росія), системи API (Франція) і багато інших. Другий тип систем заснований на використанні багаторядних планшетів, що дозволяють одночасно проводити ідентифікацію кількох культур. До систем цього типу відносяться тест-системи фірми Lachema (Чехія), ММТ Е (Росія), Enterotube II (США) і ін. У кожну клітинку засівають суспензію культури бактерій певної густоти. У контрольні осередку наливають фізіологічний розчин. Інкубація тест-систем проводиться в звичайних термостатах або в спеціальних термостатіруемого пристроях, що входять в комплект автоматизованих систем, де облік результатів і їх інтерпретація здійснюється автоматично за допомогою комп'ютера (Vitek, BioMerieux, Франція). Результат враховують після 3-4-годинної інкубації в термостаті візуально або при використанні автоматизованої комп'ютерної системи по зміні кольору індикатора. Мікротест-системи особливо зручні при масових бактеріологічних дослідженнях в практичних лабораторіях.

Системи індикаторні паперові (СІБ) представляють собою набори паперового дисків для виявлення найрізноманітніших ферментів бактерій. Диски просякнуті субстратом (вуглеводами, амінокислотами, цитратом, ацетатом, малоната і іншими речовинами), а також містять індикатор. Повну петлю досліджуваної культури або краплю густий мікробної суспензії вносять в стерильний фізіологічний розчин (в деяких випадках в забуферений: рн 5,4-5,6) або в 1% пептони воду і поміщають в цю пробірку відповідний диск. У контрольні пробірки культуру бактерій не вносять. Для визначення сірководню диск поміщають в пробірку на поверхню МПА, засіяного уколом, що дозволяє одночасно визначити рухливість. Після інкубації в термостаті оцінюють результати тестів по зміні кольору середовища і диска. Утилізація речовини призводить до зміни кольору індикатора. У всіх пробірках враховують попередній результат в той же день і остаточний - через вісімнадцять-двадцять чотири години. Є набори, які містять від десяти до тридцяти тест-папірців.

Контрольні питання.

Які особливості ферментних систем бактерій? Види ферментів: по їх дії; по виділенню в навколишнє середовище; конститутивні і адаптивні ферменти. Яке практичне значення має вивчення ферментативної активності бактерій? Методи вивчення протеолітичної і сахаролитической активності бактерій. Диференційно-діагностичні середовища: перерахуйте, назвіть основні складові частини і застосування. На яке зміна середовища реагує індикатор в цих середовищах? За якою ознакою диференціюються бактерії на середовищах Ендо, Левіна, Плоскірєва? Яким властивістю повинні володіти бактерії, щоб утворити на цих середовищах забарвлені колонії? Якщо бактерії утворюють безбарвні колонії, що це значить? Середовища Гіссен, їх склад і застосування. Що таке «строкатий» або «кольорової» ряд? Середа Олькеницкого, як проводиться посів і як відзначають на цьому середовищі ферментативні властивості бактерій? Методи визначення протеолітичної активності бактерій: розрідження желатину, освіта індолу, сірководню, аміаку. Що являють собою мікротестсістеми для визначення ферментативної активності бактерій: як проводять посів і як враховують результати? Що таке СІБ, як використовується ця система, як проводиться посів та облік результатів?



Після вивчення теми студент повинен вміти. | Завдання на самостійну роботу.

Завдання для виконання в процесі самопідготовки. | заняття 4 | Після вивчення теми студент повинен вміти. | Робота студента на практичному занятті. | Після вивчення розділу студент повинен вміти. | Контрольні практичні завдання по розділу «Історія мікробіології. Морфологія мікробів і вірусів ». | Після вивчення теми студент повинен вміти. | Додатковий матеріал до заняття. | Завдання для виконання в процесі самопідготовки. | Продовження). |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати