Головна

Спектральні методи аналізу | переваги методу | Основний принцип хроматографічного розділення. | Пристрій рідинного хроматографа | Інжектори | Детектори для ВЕРХ | колонки | Методики виконання лабораторних робіт | Метод РН диференціальної спектрофотометрії визначення масової частки суми антоцианінів в сокової продукції. | Спектрофотометрическое визначення кількісного вмісту аскорбінової кислоти (вітаміну С) в напоях. |

Основи ионообменного методу

  1. ЦД. 08 Робочі процеси, конструкція і основи розрахунку автомобільних двигунів
  2. I Фізичні основи механіки
  3. I. ОСНОВИ ДОСЛІДЖЕННЯ мікросередовища
  4. I. Теоретичні основи фінансового менеджменту
  5. II. МЕТРОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ИЗМЕРЕНИЙ
  6. II. Основи молекулярної фізики і термодинаміки
  7. II. Основи молекулярної фізики і термодинаміки

У іонообмінної хроматографії метод заснований на тяжінні протилежно заряджених частинок, де нерухома тверда фаза зазвичай складається з сорбенту ( «смоли») з ковалентно зв'язаними анионами або катіонами. Протилежно заряджені іони розчиненого речовини в рідкій, рухомий фазі електростатичними силами притягуються до іонів сорбенту. Адсорбовані компоненти зразка потім елюіруют із застосуванням сольового градієнта, який поступово десорбуються молекули зразка в порядку збільшення електростатичного взаємодії, з іонами в колонці

Ионообменная хроматографія характерна високою роздільною здатністю, великий ємністю і не замінна при поділі високополярних речовин, які без перекладу в похідні не можуть бути проаналізовані методом ГРХ. До таких сполук відносяться амінокислоти, пептиди, цукру. нуклеїнові кислоти, полінуклеотіди і інші заряджені молекули.

Іонообмінну хроматографію широко застосовують в медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища, при аналізі змісту ліків і їх метаболітів в крові і сечі. Також її використовують для аналізу отрутохімікатів в харчовій сировині, для поділу неорганічних сполук, в тому числі радіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів і ін. Аналіз біополімерів (білків, нуклеїнових кислот і ін.), На який зазвичай витрачали години або дні, за допомогою іонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з найкращим поділом.

Поділ конкретних речовин залежить в першу чергу від вибору найбільш підходящого сорбенту і рухомої фази.

Як нерухомих фаз в іонообмінної хроматографії застосовують іонообмінні смоли і силикагели з щепленими йоногенних групами.
 Існує два типи ионообменников - катіонообмінники і аніонообменнікі. Катіонообмінники містять негативно заряджені групи і притягують позитивно заряджені частинки - катіони. такі

ионообменники називають також кислотними іонообмінниками, оскільки їх негативний заряд виникає в результаті іонізації груп з кислотними властивостями. Аніонообменнікі містять позитивно заряджені групи, які притягують негативно заряджені частинки - аніони. За аналогією, для них застосовується термін основні ионообменники, оскільки їх позитивний заряд зазвичай є результатом приєднання протона до основних груп.

Механізм іонного обміну прийнято розглядати з наступних етапів:

?дифузія іона до поверхні іонообмінника (в гомогенних розчинах відбувається швидко)

? дифузія іона крізь матрицю іонообмінника до ділянки обміну (залежить від кількості перехресних зшивок в матриці і концентрації розчину). Вважається, що дана стадія визначає швидкість іонного обміну в цілому.

? Обмін іонів відбувається миттєво і являє собою рівноважний процес.

катіонообменнік

Смола - (SO3 )- ... H+ + Na+ - Смола - (SO3 )- ... Na+ + H+

аніонообменнік

Смола-N+ ... CI- + -OOC - Смола-N+ ... -OOC + CI-

Чим більше заряд на обмінюваної молекулі, тим міцніше вона зв'язується з іонообмінником і тим важче її витіснити іншими іонами.

Збереження електронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонного обміну протиіонів, розташованих в безпосередній близькості до поверхні. Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту, обмінюється з протиіоном. Речовини, що мають різний спорідненість до фіксованих зарядом, поділяються на аніонітах або на катіоніти. Аніоніти мають на поверхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фази аніони. Катіоніти відповідно містять групи з негативним

зарядом, які взаємодіють з катіонами.

В якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, підстав і розчинники типу рідкого аміаку, т. Е. Системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності і велику тенденцію іонізувати з'єднання. Зазвичай працюють з буферними розчинами, що дозволяють регулювати значення рН.
 При хроматографическом поділі іони аналізованого речовини конкурують з іонами, що містяться в елюенті, прагнучи вступати у взаємодію з протилежно зарядженими групами іонообмінника. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можна застосовувати для поділу будь-яких з'єднань, які можуть бути будь-яким чином іонізовані.

Природно, що іони зразка, слабо взаємодіють з іонообмінником, при цій конкуренції будуть слабо утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, більш сильно утримувані іони будуть елюіровать з колонки останніми. В основному виникають вторинні взаємодії неіонної природи за рахунок адсорбції або водневих зв'язків зразка з неіонної частиною матриці або за рахунок обмеженої розчинності зразка в рухомій фазі. Важко виділити «класичну» іонообмінну хроматографію в «чистому» вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять з емпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообмінної хроматографії.

Серед матриць можна назвати полістирол, целюлозу, агарозу.

Функціональні іонізіруемие групи Сульфонатні (-SO3-) І четвертичная амонійна (-N+R3) - Сильні ионообменники, оскільки вони повністю іонізовані при стандартних робочих значеннях РН; карбоксильная (- СОО-) Група і діетіламмоній (-НN+ (CH2 CH3 )2 )- слабкі ионообменники, оскільки вони іонізовані лише у вузькому діапазоні Рн.

Приклади найбільш часто іспользуюмих ионообменников представлені в таблиці 2.5.1

Таблиця 2.5.1

Властивості деяких важливих ионообменников

 функціональна група  типи іонообмінника  інтервал рН
 \ -N+ - СН3  /  Четвертинний амін (сильний аніон)  1-11
 -NH2  Первинний амін (слабкий аніон)  1-8
 \ NH /  Вторинний амін (слабкий аніон)  1-7
 \ - N /  Третинний амін (слабкий аніон)  1-6
 - СОО -  Вугільна кислота (слабкий катіон)  6-14
 - SO3 -  Сульфокислота (сильний катіон)  1-14

Застосовувані в ВЕРХ іонообмінні смоли представляють собою в основному сополімери стиролу і дивинилбензола. Звичайно додають 8-12% останнього. Чим більше зміст дивинилбензола, тим більше жорсткість і міцність полімеру, вище ємність і, як правило, селективність і тим менше набухає. Діаметр частинок таких сорбентів складає від 5 до 25 мкм. Більшість ионообменников для ВЕРХ стабільні до 60 ° С., Так, що поділ можна здійснювати при цій температурі: зі зростанням температури падає в'язкість рухомої фази і отже, збільшується ефективність розділення. Деякі полімерні катіонообмінники витримують температуру і навіть до 80 ° С.


 2.5.2 Вибір рухомої фази і умов поділу.

Іонообмінне, поділ зазвичай виконують при застосуванні водних розчинів солей, яким надаються буферні властивості. Іноді додають в ПФ невелика кількість змішуються з водою органічних розчинників - метанолу, етанолу, ацетонітрилу, тетрагидрофурана. Сила і селективність розчинника залежать від типу і концентрації буферних іонів та інших солей, від значення рН і від виду і

концентрації доданих органічних розчинників.

Утримання в іонообмінної хроматографії залежить від двох процесів: розподілу зразка між водної рухомою фазою і органічної нерухомою і освіти іонних пар (т. Е. Анионного або катіонного обміну), причому останній процес домінує.
 Сила електростатичного взаємодії заряджених іонізованих груп речовини з зарядженими групами іонообмінника впливає на розподіл речовини між фазами. Деякі гідрофобні сполуки або речовини, здатні утворювати водневі зв'язки, можуть

взаємодіяти з матеріалом матриці неспецифически.

Ступінь утримування зразка знижується зі збільшенням іонної сили рухомої фази і збільшується зі збільшенням іонообмінної ємності сорбенту. Іонна сила рухомої фази зростає при зростанні концентрації буфера і збереженні незмінним рН або при додаванні солі. Важлива також концентрація буферних розчинів, так як в розчині спостерігається конкуренція між іонами зразка і буфера. Зменшення концентрації буферного розчину збільшує спорідненість смоли до зразка, що призводить до збільшення часу утримування. Концентрація буферного розчину зазвичай знаходиться від 0,001 до 6 моль / л, причому верхня межа визначається розчинністю солі, використовуваної в якості буфера, а нижня - самої буферної силою, так як в слабкому буферному розчині можна контролювати рівень рН. Сильних буферних розчинів також слід уникати, так як можливе випадання осаду і забивання колонок.
 У іонообмінної хроматографії застосовують такі буферні розчини: ацетатний, фосфатний, цитратний, форміатний, аміачний, боратний. Селективність поділу в іонообмінної хроматографії залежить від концентрації і виду буферних іонів і органічних розчинників, а також від рН середовища.

Біохімічні проби прийнято розділяти при низьких температурах, часто при 4 ° С, хоча в сучасній ВЕРХ при швидких поділах ймовірність руйнування зразка при 20-30 ° С різко знижується. Підвищення температури може призвести до зниження k 'для всіх компонентів зразка, а зниження іонної сили рухомої фази може привести до зворотного явища.
 Введені кількості зразка не повинні перевищувати 5% сумарної іонообмінної ємності. Так, для з'єднань з молекулярної масою 200-500 передбачається введення близько 50 мг проби на 1 г полімерного сорбенту.

Бажано, щоб об'єм, що вводиться зразка не перевищував 1/3 об'єму

першого цікавить піку.

 



Визначення вмісту вітамінів В1, В2 методом ВЕРХ у премікси. | проведення випробування
© um.co.ua - учбові матеріали та реферати