На головну

Радіальна (розподільча) рідинна хроматографія

  1. рідинного змащення
  2. Або абразивно-рідинна обробка (ажо)
  3. Робота № 5. Тонкошарова хроматографія ліпідів тканини мозку.
  4. хроматографія

принцип методу. Окремі амінокислоти володіють різною розчинністю в двох частково змішуються рідинах, однією з яких є вода, інший - водонасищенний органічний розчинник, наприклад, фенол, бутанол з оцтовою кислотою. З двох частково змішуються рідин один розчинник повинен бути полярним - нерухома фаза, а інший неполярних - рухома фаза. Більш гидрофобная амінокислота або іншу речовину, краще розчиняється в неполярному розчиннику, рухається з більшою швидкістю від лінії старту, ніж гідрофільна амінокислота. В результаті цього суміш амінокислот після закінчення хроматографічного поділу виявляється на різній відстані від лінії старту.

Радіальну хроматографію проводять на папері в чашці Петрі. Розчинник переміщається від центру до периферії і захоплює амінокислоти, які розподіляються концентричними колами і виявляються після висушування паперу і проведення Нінгідринова реакції.

реактиви: 0,5% розчин суміші амінокислот: аланін, аргініну і лейцину. Можна використовувати суміш інших амінокислот, Rf яких при роботі з відповідними розчинниками різко відрізняються один від одного. Розчинник: змішують 40 мл бутилового спирту, 10 мл крижаної оцтової кислоти і 50 мл дистильованої води. Після розшарування використовують верхній шар оцтової кислоти з бутанолом, насичений водою. 0,1% розчин нингидрина на водонасиченому бутиловом спирті.

Хід роботи:На диску фільтрувального паперу за допомогою 2-х паралельних розрізів виділяють паперовий «хвостик». Розрізи повинні проходити від краю до середини диска і розташовуватися один від одного на відстані 1см. Потім паперовий «хвостик» вкорочують на 1,5 - 2 см і відгинають за місцем з'єднання з папером перпендикулярно площині диска. Для отримання при хроматографії цілком круглих зон необхідно, щоб довжина розрізів була однаковою (рис.1). Розчин суміші амінокислот (0,002 мл) наносять на місце згину і висушують на повітрі. Потім паперовий диск поміщають між двома половинками чашки Петрі, нижня з яких наполовину заповнена розчинником.

 
 

 Швидкість хроматографирования залежить від ширини «хвостика» і від відстані між поверхнею рідини і поверхнею паперу, а також від якості фільтрувального паперу.

 
 

 Через 1 годину, коли розчинник на диску фільтрувального паперу матиме діаметр 6-7 см, папір висушують на повітрі або в сушильній шафі при температурі 70 - 800З для видалення розчинника. Висушену хроматограму швидко, одним рухом, змочують розчином нингидрина, налитим в чашку Петрі, і знову висушують в сушильній шафі при температурі 90-1000З протягом 5 хвилин. При цьому виявляються амінокислоти у вигляді трьох кілець, забарвлених в фіолетово-червоний колір, які вказують на поділ аланина, аргініну і лейцину.

Рис 1 Заготівля для хроматограми Рис. 2 Хроматограмма.

Для кожної амінокислоти розраховують коефіцієнт Rf або швидкість переміщення по формулі: а / b, де а - відстань в міліметрах, пройдене амінокислотою від місця нанесення амінокислоти до середини її плями; b - відстань в міліметрах від місця нанесення амінокислоти (лінії старту) до фронту розчинника (рис. 2). Чим менше розчинність амінокислоти в воді і чим більше її розчинність в органічному розчиннику, тим швидше вона рухається слідом за фронтом органічного розчинника, тим більше величина Rf, і, навпаки, чим більше її розчинність в воді і менше в органічному розчиннику, тим повільніше амінокислота буде пересуватися і тим менше величина Rf. Порівнюють коефіцієнт розподілу відомих стандартних амінокислот з коефіцієнтом розподілу амінокислот, отриманих для досліджуваної суміші і визначають наявність окремих амінокислот в досліджуваному матеріалі. Rf для аланіну має бути в межах від 0,40 до 0,42; для аргініну - 0,12-0,20; для лейцину - 0,60-0,72.

Питання для самоконтролю:

1. Які існують різновиди хроматографічного методу розділення речовин?

2. У чому полягає сутність хроматографічного методу визначення амінокислот на фільтрувальної папері?

3. Яка фаза розчинника в даній роботі є рухомий, а яка - нерухомою?

4. Від чого залежить коефіцієнт розподілу амінокислот?

5. Для чого в цій роботі проробляють реакцію з нингидрином?




Теоретична частина. | Формоловая титрування.

А) Основна | Загальні правила роботи в лабораторії. | Техніка безпеки та заходи безпеки. | Надання першої допомоги. | Біуретова реакція | Нінгідринова реакція. | Ксантопротеиновая реакція (Мульдера). | Реакція Фоля. | Реакція на тирозин (Миллона). | Теоретична частина. |

© um.co.ua - учбові матеріали та реферати